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開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創(chuàng)造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇動物行為學(xué)的研究，希望這些內(nèi)容能成為您創(chuàng)作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進步。
摘 要:目的:以慢性焦慮應(yīng)激大鼠為載體,探討其焦慮狀態(tài)及行為學(xué)的變化,旨在探索能較好模擬廣泛性焦慮障礙的動物模型。方法:采用慢性情緒應(yīng)激的方法建立焦慮大鼠模型,以國際公認(rèn)的高架十字迷宮試驗對其行為學(xué)進行評價。結(jié)果:應(yīng)激后大鼠處于易激惹的狀態(tài),表現(xiàn)出頻繁的修飾和攻擊行為,經(jīng)高架十字迷宮測試發(fā)現(xiàn)大鼠較少進入并停留于開放臂中,傾向于探究封閉臂,且在封閉臂的停留時間延長。結(jié)論:不確定性空瓶刺激作為一種慢性心理應(yīng)激模型,從病因?qū)W上較好模擬了廣泛性焦慮障礙的發(fā)病狀態(tài)和行為學(xué)表現(xiàn)。
關(guān)鍵詞:焦慮模型;行為學(xué);慢性情緒應(yīng)激;高架十字迷宮
中圖分類號:R332 文獻標(biāo)識碼:A 文章編號:1673-7717(2010)04-0711-03
The Changes in Behaviour of Rats with Chronic Stress-induced Anxiety and
Behavioural Evaluation of The Elevated Plus-maze Test System
LI Ning 1,TANG Qisheng2,ZHAO Ruizhen2 , GOU Shengle1
(1. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029,China;
2. The Third Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029,China)
Abstract:Objective:To study the changes in behaviour of rats model with chronic stress-induced anxiety and to explore a appropriate animal model for GAD. Methods:Rats model was established by using chronic emotional stress-induced anxiety method, then researchers observed behavioural changes of model rats and evaluation of elevated plus-maze test system. Results:Rats resceiving emotional stress was in a state of great agitation,who manifested obvious grooming and attacking behaviour.Fewer rats entered and remained in the open arm,and tended to explore and stay in the closed arm.Conclusion:Unpredictable bottle stimulation as a methd of chronic emotional stress better simulated the incidence and manifestation of generalized anxiety disorder from etiology.
Key words:anxiety model; behaviour;chronic emotional stress; elevated plusmaze
收稿日期:2009-11-21
基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(30772804)
作者簡介:李寧(1980-),女,河南許昌人,博士研究生,研究方向:中醫(yī)藥防治腦血管疾病。
通訊作者:唐啟盛(1956-),男,黑龍江人,教授,博士研究生導(dǎo)師,研究方向:中醫(yī)藥防治腦血管。
廣泛性焦慮障礙(generalized anxiety disorder,GAD)是以過度和持續(xù)性焦慮或反復(fù)發(fā)作的驚恐不安為主要特征的神經(jīng)癥,常伴有植物神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和運動性緊張。隨著臨床和基礎(chǔ)實驗研究的不斷深入與完善,人們對于本病也有了較為系統(tǒng)而全面的認(rèn)識。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,其發(fā)病涉及生物、心理、社會等諸多方面的因素,但確切的病因和發(fā)病機制至今尚未徹底闡明。焦慮動物模型作為基礎(chǔ)實驗研究的平臺與載體,在探索焦慮障礙的病因、發(fā)病機制以及新藥研發(fā)等方面發(fā)揮著重要作用。因此,選擇公認(rèn)、穩(wěn)定、重復(fù)性好、能反映復(fù)雜發(fā)病狀態(tài)的動物模型是深入開展該疾病研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究采用慢性情緒應(yīng)激的方法建立焦慮大鼠模型,觀察應(yīng)激前后自身行為學(xué)的變化,且通過國際公認(rèn)的高架十字迷宮試驗對其焦慮狀態(tài)進行測試與評價,旨在為廣泛性焦慮障礙的研究提供較好的動物模型。
1 材 料
1.1 實驗動物
健康Wistar雄性大鼠20只,SPF級,2～3月齡,體重(200±10)g。由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所購買,合格證號:SCXK(京)2005-0013。動物購進后預(yù)養(yǎng)1周內(nèi)自由攝食飲水。光照節(jié)律12L/12D(6∶00～18∶00),室溫(20±2)℃,相對濕度為50%～60%,保持安靜。
1.2 行為學(xué)測試儀器
高架十字迷宮采用國際通用的方法制作[1],由安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)。
2 方 法
2.1 動物分組和焦慮模型的建立
大鼠經(jīng)1周適應(yīng)期后隨機分為正常組、模型組,每組10只。除正常組外,模型組單籠飼養(yǎng)且接受不確定性空瓶飲水刺激建立焦慮應(yīng)激模型[2] 。具體方法如下:定時喂水訓(xùn)練7天,即每天早9∶00～9∶10和晚21∶00～21∶10給動物飲水10min,其余時間撤去水瓶不給水。定時喂水期結(jié)束后開始應(yīng)激實驗,在上述兩個時間段內(nèi)給予不確定空瓶刺激,維持1天1次或1天2次,持續(xù)2周。正常組不接受任何處理,自由飲水和攝食。所有動物在應(yīng)激結(jié)束后進行高架十字迷宮行為學(xué)測定,兩組交叉進行。動物均提前2h進入測試實驗室適應(yīng)環(huán)境。
2.2 行為學(xué)觀察
行為學(xué)觀察包括攻擊(咬或攻擊空瓶和籠子)、探究(前后左右運動和光顧水瓶所在位置)及修飾行為(梳理皮毛和洗臉)。具體方法是將空瓶應(yīng)激的10min等分10個時間段,在每個時間段內(nèi)記錄每只大鼠上述3種行為,行為出現(xiàn)即為1,否則為0.10min內(nèi)觀察的總分為0～10之間。得分基于2 名觀察者的觀察結(jié)果平均而得,其中一人為雙盲控制。14個觀察日的前3天和最后3天的平均分用于統(tǒng)計分析。
2.3 行為學(xué)測試
實驗室內(nèi)光線昏暗(以1.5m 距離處能區(qū)分大鼠細(xì)微活動的最低亮度為準(zhǔn))并保持恒亮,室溫21℃,安靜。測試箱放置于實驗室一角,周圍布以2m 高黑色單調(diào)背景。實驗過程中只有一名參與日常處理的人員搬運動物。
迷宮測試前將每只大鼠放入一個60cm×60cm×35cm塑料盒中,任其自由探究5min后迅速置于EPM 的中央平臺處使其頭部正對其中一個開放臂,釋放后即開始記錄下述指標(biāo): ①進入開放臂次數(shù)(open arm entry,OE):進入到任一開放臂的次數(shù),以大鼠4個爪子均進入到臂內(nèi)為準(zhǔn),中途一個爪子從該臂中完全退出則為該次進入活動完成; ②進入開放臂時間(open arm time,OT):進入開放臂的時間,單位:秒; ③進入封閉臂次數(shù)(close arm entry,CE):進入任一封閉臂的次數(shù),以大鼠4個爪子均進入到臂內(nèi)為準(zhǔn);④進入封閉臂時間(close arm time,CT):進入封閉臂的時間,單位:秒;⑤向下探究次數(shù)(head-dipping,HD):大鼠置身于中央平臺或開放臂時,一邊用前爪握住迷宮邊緣一邊把頭部和肩部伸出開放臂的邊緣向迷宮下面探究的行為次數(shù); ⑥封閉臂后腿直立次數(shù)(rearing,RR):大鼠在封閉臂前腿抬起以后腿支持使身體豎立的次數(shù)。
由①～④分別計算出:①進入開放臂和封閉臂的總次數(shù)(OE+CE):表示大鼠的運動活力;②進入開放臂次數(shù)比例(OE%):即開放臂進入次數(shù)/(OE+CE)×100%;③開放臂停留時間比例(OT%),即開放臂停留時間/(OT+CT)×100%,每只大鼠測試5min。
2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析
各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。數(shù)據(jù)處理采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分析處理,兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。以P
3 結(jié) 果
3.1 模型組大鼠行為學(xué)的變化
如表1所示,空瓶應(yīng)激期間,模型組大鼠14個觀察日的前3天和最后3天相比,探究行為無明顯差異(P>005),修飾行為增多(P
表1 模型組14個觀察日前3天和最后
3天空瓶應(yīng)激時行為變化的比較(n=10,±s)
組別探究行為修飾行為攻擊行為
起始3天5.22±0.973.22±1.121.29±0.96
最后3天4.64±1.065.58±1.076.08±1.35注:n為動物只數(shù);與起始3天比較,P
3.2 大鼠EPM測試結(jié)果
如表2所示,因正常組不施加任何干預(yù)因素,故與模型組相比OE+CE、OE%、OT%、head-dipping明顯減少,差異明顯(P
表2 各組大鼠EPM測試行為學(xué)的比較( n=10,±s)
組別OE+CE/次 OE/%OT/%HD/次RR/次
正常組 11.70±1.4934.78±5.89 35.19±4.1514.70±1.9412.50±1.81
模型組8.40±1.7814.42±4.2817.17±6.799.10±1.7913.40±2.17注:n為動物只數(shù);與正常組比較,P
4 討 論
現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)激和焦慮是密切相關(guān)的現(xiàn)象,大多數(shù)焦慮癥患者都曾經(jīng)歷過嚴(yán)重的心理應(yīng)激事件,因此應(yīng)激事件可以成為焦慮癥發(fā)病的原因和誘因[3]。本研究采用不確定性空瓶刺激建立慢性應(yīng)激焦慮大鼠模型,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過幾次固定時間的飲水學(xué)習(xí)之后,在飲水期間給予動物空瓶,能夠誘發(fā)動物出現(xiàn)攻擊,撕咬瓶子和籠子,頻繁修飾等焦慮行為。此外,模型組大鼠表現(xiàn)出易激惹的狀態(tài),與臨床中焦慮癥患者的易激惹表現(xiàn)相似。
高架十字迷宮試驗(EPM)既可以建立焦慮應(yīng)激的模型也是國際上公認(rèn)的經(jīng)典測量焦慮反應(yīng)的方法[1-4]。其原理是利用動物對新異環(huán)境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼心理,形成動物的矛盾沖突來考察大鼠的焦慮狀態(tài)。EPM測試的項目中,焦慮動物的OE%和OT%會明顯降低,經(jīng)典抗焦慮藥物則使兩者升高,OE+CE反映了動物的運動活性。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的OE%和OT%顯著下降,運動活性也降低。HD反映了動物在非保護區(qū)內(nèi)的探索行為,代表動物對陌生環(huán)境的好奇探究或因恐懼而尋求逃避,與焦慮程度有一定相關(guān)性,本研究中空瓶應(yīng)激后的大鼠HD行為減少;RR可用來觀察藥物有無鎮(zhèn)靜作用及鎮(zhèn)靜強度。上述結(jié)果證實,慢性應(yīng)激后的大鼠明顯處于焦慮狀態(tài),說明慢性焦慮應(yīng)激大鼠模型的制備成功,且通過量化的標(biāo)準(zhǔn)客觀反映出大鼠的焦慮程度。
GAD作為焦慮癥的臨床亞型,多呈慢性病程且易復(fù)發(fā),癥狀反復(fù)遷延,并與許多軀體疾病相關(guān)聯(lián),相當(dāng)比例的患者還共病抑郁和其他精神障礙類疾病,患者不僅存在難以忍受而又無法擺脫的精神痛苦,嚴(yán)重者可導(dǎo)致社會功能受損,甚至出現(xiàn)自殺,給個人家庭和社會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟和精神負(fù)擔(dān)。焦慮動物模型作為焦慮癥基礎(chǔ)研究的載體,在探索其發(fā)病機制、新藥研發(fā)及臨床前評估的研究中發(fā)揮著重要作用,但目前尚缺乏針對GAD的動物模型。基于此,本研究從病因?qū)W的角度出發(fā),建立慢性焦慮情緒應(yīng)激的動物模型,通過其自身行為學(xué)的變化和EPM測試即橫向和縱向的比較來評價該模型的可行性和有效性。雖然動物的情緒變化遠(yuǎn)不如人類豐富,動物身上也較難準(zhǔn)確模擬人類發(fā)病的心境。但是,他們也存在并非單一的情緒變化,有些情緒變化如焦慮、憤怒、恐懼等與人類存在相似性,在情緒變化時同樣也存在行為學(xué)和復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌變化[5-6]。本研究結(jié)果提示:不確定性空瓶刺激作為一種慢性心理應(yīng)激模型,能誘導(dǎo)動物出現(xiàn)明顯的焦慮行為,從病因?qū)W上較好模擬了GAD的發(fā)病狀態(tài),與現(xiàn)有的焦慮應(yīng)激模型相比,該模型在很大程度上避免了摻雜物理(軀體)性應(yīng)激成分,是一種相對“純粹”的心理應(yīng)激模型。本課題組將在此行為學(xué)研究的基礎(chǔ)上,進一步開展焦慮癥神經(jīng)生物學(xué)方面的探索性研究。
參考文獻
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[關(guān)鍵詞] 二至百合濃縮膏；抗焦慮；雌性大鼠；去勢；高架十字迷宮；明暗箱
[中圖分類號] R363 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）12-20-03
更年期綜合征是婦女在這一時期由于雌激素水平下降所致的以機體內(nèi)分泌失調(diào)、植物神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為主，伴有神經(jīng)心理癥狀的一組癥候群。二至百合組方中包含女貞子、旱蓮草、百合、知母、牡蠣等中藥組成成分，具有滋陰潛陽，退熱安神之功效。主要用于婦女更年期初期，證見陰虛陽亢，陰虛發(fā)熱，骨蒸潮熱，焦慮煩躁，失眠多夢者。本實驗通過雌性大鼠雙側(cè)卵巢祛除術(shù)復(fù)制大鼠更年期綜合征模型，觀察二至百合方對模型大鼠焦慮行為學(xué)指標(biāo)的影響，初步評價藥物的改善更年期焦慮作用。
1 資料與方法
1.1 藥品及試劑
二至百合濃縮膏，北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司（批號20120902）。
1.2 實驗動物
Wistar大鼠，75只，雌性，體重（200±20）g，SPF級，購自中國人民軍事科學(xué)院實驗動物中心。許可證編號：SCXK-（軍）2007-004。
1.3 儀器
海爾BCD-257SL冷藏冷凍冰箱：青島海爾股份有限公司；Sartorious BT 124S電子精密天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；明暗穿梭箱、高架十字迷宮、高架十字迷宮實驗視頻分析系統(tǒng)、SLY-ETS小動物行為活動記錄分析系統(tǒng)，均由北京碩林苑科技有限公司生產(chǎn)。
1.4 方法
1.4.1 動物模型制備與分組 在適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，將75只大鼠隨機分為5組，分別為：假手術(shù)空白組，模型組，二至百合高劑量（1.92 g濃縮膏/kg）、中劑量（0.96 g濃縮膏/kg）、低劑量（0.48 g濃縮膏/kg）組，每組15只。
模型組及受試樣品3個劑量組制備雌性去勢大鼠（雙側(cè)卵巢切除術(shù)）模型[1-2]：大鼠0.1%戊巴比妥鈉0.5 mL/100 g體重（50 mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉大鼠取俯臥位，在背部中1/3處剪毛、備皮，碘伏常規(guī)消毒。自腰椎沿背部正中線向下做縱行切口約2～3 cm，切開皮膚，沿肩胛線分別于左右兩肋下剪開腰肌，暴露出卵巢及緊密相連的子宮，在子宮角上做兩個結(jié)扎，結(jié)扎后切斷，將卵巢摘除，縫合皮膚。術(shù)后連續(xù)腹腔注射72萬U/kg青霉素，以防感染，1次/d，連續(xù)3 d。術(shù)后第3天開始給大鼠陰道涂片觀察，連續(xù)5 d，每天1次，以確定卵巢完全切除。實驗動物從術(shù)后的第5天起全部進入動情間期，但動物不再出現(xiàn)動情前期，動情期的雌激素變化，動物基本上符合“更年期”表現(xiàn)。假手術(shù)空白組大鼠除不行卵巢摘除外，其余步驟同模型組。
造模后9 d，除假手術(shù)空白組和模型組給予等體積蒸餾水外，其余各組開始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)45 d后分別進行高架十字迷宮和明暗箱行為學(xué)實驗測試（先開展高架十字迷宮實驗，其后間隔1周后開展明暗箱實驗）。
1.4.2 大鼠高架十字迷宮實驗 末次給藥30 min后，進行高架十字迷宮行為學(xué)的測評。實驗開始時，將大鼠放入高架十字迷宮中央，頭朝開臂，觀察5 min內(nèi)大鼠的活動情況[3-5]。觀察并記錄以下各項指標(biāo)：進入開臂次數(shù)，進入閉臂次數(shù)，以及在兩臂的滯留時間。分別計算大鼠進入開臂的時間占總時間（開臂和閉臂滯留的時間之和）的百分比（open arm time percent，OT%），以及大鼠進入開臂的次數(shù)占總次數(shù)（開臂與閉臂之和）的百分比（open arm entry percent，OE%）。觀察時以大鼠四爪均進入開臂或閉臂為準(zhǔn)。
1.4.3 大鼠明暗箱實驗 末次給藥30 min后，將大鼠置于明箱中央，背朝通道，觀察5 min內(nèi)大鼠的活動情況并記錄明暗箱停留時間和穿箱次數(shù)。
以上兩種行為學(xué)檢測實驗操作時，應(yīng)保持外界環(huán)境安靜，每次放入大鼠前清理干凈箱內(nèi)的排泄物，盡可能保證每批次檢測的客觀性。
1.5 統(tǒng)計學(xué)處理
采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)以（）表示，數(shù)據(jù)先進行方差齊性檢驗。方差齊選用One-Way ANOVA法進行各組間比較；方差不齊選用t檢驗進行組間比較。
2 結(jié)果
2.1 二至百合濃縮膏對去勢大鼠高架十字迷宮行為活動的影響
實驗結(jié)果顯示，模型組組大鼠與假手術(shù)空白組比較，OE%和OT%顯著減小（均P
2.2 二至百合濃縮膏對去勢大鼠明暗箱穿梭行為的影響
研究結(jié)果顯示，模型組大鼠明箱停留時間和穿箱次數(shù)均顯著降低，與假手術(shù)空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（分別P
3 討論
更年期綜合征[6]屬于中醫(yī)學(xué)“絕經(jīng)前后諸癥”范疇，歷代文獻關(guān)于本病的論述散見于“臟躁”“心悸”“失眠”“眩暈”“頭痛”“郁證”等病癥中。絕經(jīng)前后腎臟虛損，腎氣漸衰，耗傷，陰陽平衡失調(diào)，臟腑功能紊亂而出現(xiàn)絕經(jīng)前后諸癥證候[7]。隨著我國人口結(jié)構(gòu)不斷老齡化和社會競爭日益激烈，不良的工作環(huán)境、家庭關(guān)系緊張及精神等因素影響，婦女進入更年期逐漸增加、年齡提早，從而使更年期焦慮癥的發(fā)病率亦明顯增加[8]。因此治療和緩解更年期綜合征焦慮癥具有重要的社會意義。
二至百合方由經(jīng)典方劑“二至丸”和“百合知母湯”合方加減而成，具有滋陰潛陽，退熱安神之功效。本研究主要通過雌性大鼠卵巢祛除術(shù)復(fù)制大鼠更年期綜合征模型，進而采用高架十字迷宮和明暗箱實驗觀察二至百合方對模型大鼠焦慮行為學(xué)的影響，評價處方的改善更年期綜合征焦慮作用。
高架十字迷宮模型，為抗焦慮研究中公認(rèn)的非條件反射模型，是抗焦慮研究中應(yīng)用最廣泛的模型之一[9]。它利用動物對新異環(huán)境的探究特性相對高懸敞開臂的恐懼心理，形成動物的矛盾行為，進入開放臂的百分?jǐn)?shù)（OE%）和在開放臂停留時間的百分?jǐn)?shù)（OT%）反映的是動物趨近規(guī)避沖突的結(jié)果，與焦慮程度直接相關(guān)。通常抗焦慮藥只增加動物對開放臂的探索，使OE%和OT%上升。開放臂和封閉臂總進入次數(shù)反映了動物總的運動能力，可用來觀察藥物有無鎮(zhèn)靜作用及鎮(zhèn)靜強度。被保護區(qū)的活動性一定程度上與抗焦慮劑的效應(yīng)相關(guān)[10]焦慮動物的OE%和OT%明顯降低，經(jīng)典抗焦慮藥物則使兩者升高[11]；明暗箱行為實驗[12-13]中，明箱活動時間越長，探洞和穿梭次數(shù)越多，反映實驗動物對新環(huán)境的探索欲望水平越高，探索欲越強則代表環(huán)境適應(yīng)能力越強，焦慮水平越低。
本實驗以去勢大鼠造成更年期模型，考慮動物行為檢測的個體差異可能比較大，所以本實驗選用了較為經(jīng)典的2種焦慮行為檢測方法進行二至百合膠囊的抗焦慮實驗。本研究表明，高架十字迷宮實驗中，與假手術(shù)空白組比較，去勢大鼠進入開閉時間和次數(shù)的百分率顯著下降，在明暗箱實驗中，與假手術(shù)空白對照組比較，去勢大鼠在明箱停留時間明顯縮短，穿箱次數(shù)明顯減少。由此提示，去勢動物處于焦慮狀態(tài)。高架十字迷宮實驗中，二至百合濃縮膏3個劑量組均可增加去勢大鼠OE%和OT%值，與模型組比較，中劑量組OE%和OT%值有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義（P
根據(jù)相關(guān)文獻報道含有百合[14-15]、知母[16-17]等藥物組方在臨床上對更年期綜合征具有明顯治療作用，有實驗表明含有女貞子[18]的復(fù)方藥物連續(xù)灌胃可明顯降低更年期大鼠血清促性腺激素FSH含量，對血清E2含量有顯著增加作用，使更年期陰虛內(nèi)熱、煩躁不安、失眠等癥狀得以緩解。
本實驗研究結(jié)果表明二至百合方對更年期焦慮癥狀有明顯改善，對更年期綜合征有一定的緩解作用，但是二至百合方改善更年期綜合征模型大鼠焦慮行為學(xué)的作用機理有待進一步深入研究。
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現(xiàn)在動物行為的研究在我國正處于起步階段，研究的內(nèi)容主要為描述性，在理論研究方面，在研究的廣度和深度方面，仍與國外存在著較大的差距。
而作為21世紀(jì)生物科學(xué)專業(yè)的一員，更有必要學(xué)好這門學(xué)科，為我國動物行為方面的研究做出自己的貢獻。出于對這個大千世界的好奇，我選擇了動物行為生態(tài)學(xué)這門學(xué)科，在老師的帶領(lǐng)下，我眼界變得開闊了，我也重新認(rèn)識了這個世界，感受到了大自然的和諧，重新認(rèn)識到了自己在這個大千世界中的價值。
在老師的推薦之下我閱讀了《小鳥的大道理》這篇短小卻飽含動物之間哲理的文章，它不是作家創(chuàng)造出來的世界，它不同于一般的文章，它是最基本的事實！是戴維斯生活的每一天每一夜，是獨自的，安靜的，幾乎與世隔絕的寂寞與艱辛，更是展示給我們的精華。
戴維斯一個將自己的精力放在小鳥身上的偉大科學(xué)家，在小鳥的繁殖季節(jié)里他幾乎每天都要去拜訪他們，比如像籬雀這種樣子很像麻雀，羽毛顏色黯淡，看上去很單調(diào)的不起眼的小鳥，在戴維斯的眼中，它的生活可是一點也不謙遜、正派。
他描述道：
“一對籬雀在一起覓食，安詳?shù)靥M樹叢中。到那里以后，雄鳥跑到一邊，雌鳥去了另一邊。一旦出了雄鳥的視線，雌鳥立即飛進附近的矮樹叢里，和藏在那里的另一只雄鳥。過后她立即和配偶會合，做出好像什么都沒有發(fā)生過的樣子。”
雖然鳥類常常被當(dāng)情的象征，天鵝、愛情鳥、鴛鴦這些美麗的鳥兒也經(jīng)常成為詩人謳歌的對象，但是它們的相親相愛顯然不是出于感情，而只是為了傳播基因。它們的生活被達(dá)爾文法則決定了：留下盡可能多的后代。雌、雄為此走在了一起，但是它們的利益并不總是一致的，其生理特征導(dǎo)致了它們的目標(biāo)有所差異：雄性是要盡可能多地播種，雌性則是要盡可能多地養(yǎng)育自己的后代。對雌性來說，對自己最有利的婚姻形式是一妻多夫制，其次是一夫一妻制，第三是一夫多妻制。對雄性來說，則倒了過來，最好的形式是一夫多妻制，其次是一夫一妻制，第三是一妻多夫制。
雌性和雄性在長期進化過程中相互博弈的結(jié)果，讓大多數(shù)鳥類都采用了一夫一妻制，這樣做似乎對雌雄雙方都很公平。但是籬雀這種外表單調(diào)的小鳥卻有著最豐富的婚姻形式：一夫一妻制、一夫多妻制、一妻多夫制都存在著，還普遍存在多夫多妻制。
戴維斯發(fā)現(xiàn)，那些表面上是一夫一妻制的家庭，雌鳥通常也會主動勾引第三者來，這么做會鼓勵第三者為雌鳥的后代提供食物。而雌鳥的原配一旦發(fā)覺，會盡力把第三者趕走。根據(jù)達(dá)爾文法則，第三者應(yīng)該根據(jù)是否與雌鳥成功地來決定要不要為雌鳥的后代服務(wù)。如果成功，雌鳥的后代中有可能有第三者的種，第三者去幫忙才會增加自己的基因傳播的機會，不然就是在做無償服務(wù)了。
籬雀多姿多彩的家庭生活，其實是兩性既合作又沖突的結(jié)果，雙方都想利用對方來為自己留下盡可能多的后代。這個適用于所有有性生殖的生物的道理，卻由一種不起眼的小鳥如此鮮明地證明了。
求偶是動物繁衍的前奏，也是動物種群自我選育、優(yōu)育的基礎(chǔ)。是一方動物向另一方動物炫耀各種信號或做出各種動作的行為方式。求偶行為對保護種群的優(yōu)良素質(zhì)，更好地適應(yīng)自然環(huán)境，具有重要的意義，主要表現(xiàn)在以下幾點。
（1）每種動物的求偶行為都有物種的特異性，即使是很相近的物種也有細(xì)微的差異，這可以避免不同動物的種間雜交。種間雜交在相近物種之間也有時發(fā)生，如馬和驢雜交生騾，獅和虎也能雜交產(chǎn)仔，但這種情況大多是發(fā)生在人工喂養(yǎng)的特殊環(huán)境下。
（2）求偶行為使雌雄雙方有更多選擇機會，使后代獲得良好的遺傳基因組合。求偶不成的，常常是群體中的弱者。例如鹿科動物，雄性為爭奪配偶而斗毆，失敗的弱者，多為幼小剛成年或年老體衰者、瘦弱有病者，它們不被雌鹿選中，對物種的繁衍有利。現(xiàn)在就來看看各類動物表現(xiàn)在求偶上的不同現(xiàn)象：
魚類
很多人肯定都看過電影《海底總動員》，里面奇妙而美麗的世界，色彩斑斕的魚的色彩，稀奇古怪的魚的樣子。里面我最喜歡的要數(shù)小丑魚了，哈哈。 魚的求偶有很多種，其中最為精妙杰出的求偶炫耀行為可能是座頭鯨的歌聲了，每只座頭鯨 ，都唱著它們自己的特殊歌曲，這種歌由一系列的長音符組成，而且能不停的重復(fù)演唱下去。它們的歌聲嘹亮，旋律美妙，以此來吸引異性的注意。
爬行動物
在我看來蛇是很討厭的動物，我最害怕也最不喜歡。可它們的求偶卻也比較好玩。譬如：
1、響尾蛇一旦墜入愛河，它們就會如膠似膝很難再分開，感情深厚吧。
2、羅河雄鱷在期喜歡守護著一段河堤，并大聲吼叫，嚴(yán)防其他鱷魚的闖入。雌鱷聽到叫聲后就會前來相會。雄鱷就會興奮的搖頭擺尾，并將水從鼻孔射向天空。
鳥類
鳥的求偶行為多種多樣
1、孔雀的羽毛很漂亮，但這只是雄孔雀的毛。雌孔雀有點象個丑姑娘，但美麗的雄孔雀還是喜歡追求她們。雄孔雀在求偶時會展開羽毛，變成一把金光閃閃的扇子，在高興的時候還會發(fā)出嘎嘎的響聲。
2、雄鶴是最深情的求愛者。它們在求偶過程中會用美妙的舞蹈去打動雌鶴。它們一邊上下擺頭，快速拍動雙翅，突然奔走和停止。舞蹈中的鶴如癡如醉，并常常神魂顛倒的凝視對方。
其他如燕鷗喜歡在求偶時送彩禮；啄木鳥在求愛時通過有節(jié)奏的敲打樹干，發(fā)出愛情電報；信天翁求愛時非常有禮貌，經(jīng)常以不斷彎腰向?qū)Ψ绞緪郏腥ぐ桑?/p>
哺乳動物
1、大熊貓
一只的雌熊貓，往往會引發(fā)數(shù)只雄性大熊貓的爭斗。最后最厲害的大熊貓將得到雌熊貓，并與之?dāng)y手而歸。
2、大象
處于期的大象總是通過激烈的搏斗來贏得雌大象。大象搏斗的時候用象牙做武器，龐大的身軀互相抵觸，扇動著大耳朵，并發(fā)出大聲的吼叫，直至一方落敗。
3、駱駝
駱駝是沙漠之舟。它們?yōu)榱藸帄Z妻子，常常失去了平時的溫和，變得異常兇猛。兩只公駱駝在打斗的時候，往往把對方摔倒在地上，并咬住對方的脖子。
【關(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細(xì)胞；底蛻膜；神經(jīng)保護；帕金森病
中圖分類號：R742.5；R457.7文獻標(biāo)識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2016.05.001
【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of human placental decidua basalisderived mesenchymal stem cells（hPDBMSCs） striatum transplantation in the treatment of Parkinson’s disease（PD） on rat models.MethodshPDBMSCs were cultured in vitro.PD rat models were prepared by 6OHDA and divided into transplantation group，sham operation group and model group.HPDBMSCs transplantation was performed on the right striatum of the transplantation group，and behavioral detection was carried out 1W，2W and 4W after operation.Immunohistochemical method was used to detect expression of tyrosine hydroxylase （TH） in wounded sides among all the groups 1W，2W and 4W after transplantation.Results2W and 4W after transplantation，mean rotational circle induced by apomorphine（APO） in the transplantation group were lower than those in the sham operation group and the model group（P
【Key words】mesenchymal stem cells；decidua basalis；neuroprotection；PD
帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）是一種較為常見的中老年人神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前臨床上尚無有效方法延緩疾病的進展。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，研究人員開始探索通過細(xì)胞移植來延緩或抑制中腦黑質(zhì)部多巴胺能神經(jīng)元的凋亡，從而恢復(fù)神經(jīng)環(huán)路中多巴胺遞質(zhì)的水平治療PD。目前已有研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）移植能夠改善帕金森病模型大鼠的行為學(xué)癥狀。人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human placental decidua basalisderived mesenchymal stem cells，hPDBMSCs）具有和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的形態(tài)學(xué)、免疫表型和功能特點[1]。因而，本實驗擬通過對PD大鼠紋狀體進行hPDBMSCs移植，探討人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植對PD模型大鼠的行為學(xué)的影響。
1Y料與方法1.1材料
1.1.1實驗動物實驗中所用大鼠均為SPF級SD大鼠，雌雄各半，共100只，體重180～220 g，8～12周齡，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（許可證號：SCXK桂2003-0005）。
分組1移植前1移植后1 W12 W14 W移植組111.1±1.8110.3±1.718.8±1.6ab15.8±1.4ab假手術(shù)組110.8±1.5111.2±1.4110.9±1.7111.1±2.0模型組111.3±1.7111.2±1.5110.8±2.0110.9±1.6F10.4112.0518.02157.19P10.66710.13910.00091
2.3TH免疫組化染色結(jié)果通過TH免疫組化實驗我們發(fā)現(xiàn)（見表2、圖2）：模型組與假手術(shù)組手術(shù)前后腦黑質(zhì)部位損傷側(cè)與健側(cè)陽性細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。移植組中，術(shù)后2 W及4 W損傷側(cè)陽性細(xì)胞數(shù)與健側(cè)陽性數(shù)相比明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P
表2各組大鼠黑質(zhì)不同觀察點TH表達(dá)（n=6，%，±s）
分組1移植前1移植后1 W12 W14 W移植組122.1±1.7128.6±1.8ab132.5±2.0ab143.2±1.9ab假手術(shù)組121.5±1.4121.6±1.3121.8±1.5120.9±1.4模型組121.7±1.6122.1±1.2121.7±1.6120.8±1.5F10.23143.09178.711383.27P10.8001
A：假手術(shù)組1 W時TH表達(dá)；B：假手術(shù)組2 W時TH表達(dá)；C：假手術(shù)組4 W時TH表達(dá)；D：移植組1 W時TH表達(dá)；E：移植組2W時TH表達(dá)；F：移植組4 W時TH表達(dá)。
3討論據(jù)統(tǒng)計，帕金森病在60歲以上人群中，其發(fā)病率超過1%，是中老年人常見的致殘疾患之一[3]。現(xiàn)有研究認(rèn)為，PD的主要病變部位在中腦黑質(zhì)部以及紋狀體區(qū)域，主要病理改變是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元選擇性凋亡，使黑質(zhì)紋狀體通路DA釋放減少，從而導(dǎo)致基底節(jié)神經(jīng)調(diào)節(jié)功能的紊亂[4]。若能將合成和分泌多巴胺的細(xì)胞移植入黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)，替代已死亡的多巴胺細(xì)胞，從理論上講是最為理想的治療措施。正因如此，干細(xì)胞移植治療帕金森病被廣泛研究。間充質(zhì)干細(xì)胞被認(rèn)為是一種理想的種子細(xì)胞，主要獲取來源為骨髓、脂肪、羊膜、臍帶等。骨髓是間充質(zhì)干細(xì)胞的最初來源，然而研究發(fā)現(xiàn)，骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞含量低，且在衰老或疾病狀態(tài)下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量及增殖分化能力將進一步下降[5]。此外，目前雖然多數(shù)研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療能夠延緩PD模型大鼠中腦黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元凋亡，從而改善其癥狀[6]。然而，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)同種異體骨髓MSC移植后移植灶周圍可見明顯的免疫反應(yīng)，并不能阻礙中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的減少和改善模型鼠的行為學(xué)癥狀[7]。但與BMMSCs相比，hPDBMSCs來源更為豐富，獲取方便，培養(yǎng)條件低，體外擴增能力強。研究發(fā)現(xiàn)，hPDBMSCs能夠表達(dá)胚胎干細(xì)胞的一些標(biāo)記物，如SSEA4、TRA160以及TRA181[8]。經(jīng)傳代培養(yǎng)數(shù)十次后hPDBMSCs仍維持原有的細(xì)胞表型，并具有較強的增殖分化能力[1]，此外，有研究表明，胎盤來源的MSC具有免疫調(diào)節(jié)作用，且這種效應(yīng)與MSC的細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，無同源性限制[9]。這些結(jié)果表明，hPDBMSCs可能是一種更為原始的MSCs，有可能是一種較為理想的移植細(xì)胞來源。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，hPDBMSCs作為一種新的間充質(zhì)干細(xì)胞來源，同樣能夠改善PD大鼠的癥狀，減少多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。
移植途徑是干細(xì)胞移植治療中值得關(guān)注的問題，移植后的效果以及移植成功與否在一定程度上取Q于移植途徑的正確選擇。對于帕金森病而言，細(xì)胞移植存在多種移植途徑，包括黑質(zhì)移植、紋狀體移植、腦室內(nèi)移植、靜脈移植等。至于何種移植方法更為有效，尚無明確定論。但有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)，在BMMSCs中，紋狀體移植效果優(yōu)于腦室內(nèi)移植及靜脈移植[10]，PD模型大鼠行為學(xué)癥狀改善更為明顯。在既往研究中，我們發(fā)現(xiàn)，hPDBMSCs靜脈移植后PD模型大鼠的行為學(xué)癥狀可以得到改善[11]。但通過對比分析，我們發(fā)現(xiàn)采用紋狀體移植后，大鼠行為學(xué)癥狀改善更為明顯。這些結(jié)果提示，紋狀體移植可能是一種更為有效的移植方式，這與既往一些學(xué)者的研究結(jié)果相符[10，12]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞移植2周后，大鼠黑質(zhì)部位TH陽性細(xì)胞數(shù)量增多。這些數(shù)據(jù)表明在PD大鼠模型中，hPDBMSCs能夠通過某些機制分化為多巴胺能神經(jīng)元替代受損的多巴胺能神經(jīng)元，或者抑制多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。
綜上所述， hPDBMSCs作為一種新的間充質(zhì)干細(xì)胞來源，通過紋狀體移植能夠更為有效地延緩多巴胺能神經(jīng)元的凋亡或者替代受損多巴胺能神經(jīng)元，改善PD模型大鼠的癥狀。但其具體機制仍有待進一步研究。參考文獻[1]Lu GH，Wang SY，Xu ZM，et al.Human placental decidua basalis-derived mesenchymal stem cells differentiate into dopamine neuron-like cells with no response to longterm culture in vitro[J].Neuroreport，2012，23（8）：513518.
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【關(guān)鍵詞】 益智寧神口服液/藥理學(xué);抽動—穢語綜合征/中藥療法;神經(jīng)遞質(zhì);疾病模型，動物;大鼠;色譜法，高壓液相
抽動—穢語綜合征(Tourette syndrome，TS)，又稱多發(fā)性抽動癥，是一種兒童期發(fā)病的慢性神經(jīng)精神障礙性疾病。臨床表現(xiàn)主要為突然、快速、反復(fù)、非節(jié)律性、不自主和刻板的運動性抽動和發(fā)聲性抽動，還可能伴有各種行為紊亂、強迫觀念與行為、認(rèn)知障礙等，可不同程度地干擾和損害兒童的認(rèn)知功能，影響社會適應(yīng)能力。本病病因尚未明確，具有明顯的遺傳傾向，多見于4～12歲的兒童，患病率約為005%～3%，近年來發(fā)病呈明顯上升趨勢，男孩多于女孩[1]。廣東省中醫(yī)院兒科在臨床實踐中運用自擬方益智寧神口服液治療該病，取得了較好的療效[2]。本實驗應(yīng)用亞氨基二丙腈腹腔注射建立抽動—穢語綜合征模型大鼠，觀察該藥對模型大鼠行為學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)的影響，現(xiàn)報道如下。
1材料與方法
11實驗動物SPF級SD大鼠60只，28～30d齡，體質(zhì)量(250±10)g，雌雄各半。由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供(許可證號:粵監(jiān)證字2008D006，批號：0037766)。
12實驗藥品亞氨基二丙腈(iminodipropionitrile，IDPN)購自Alfa Aesar公司(批號：C7323A)，中藥益智寧神口服液(由廣東省中醫(yī)院提供，批號：080201)，對照藥物為氟哌啶醇(上海信誼九福藥業(yè)有限公司，批號：08031121)。
13儀器及試劑LC26A 型高效液相色譜儀、SPD26AV 熒光檢測器、C2R4A 數(shù)據(jù)處理機均為日本島津公司產(chǎn)品，脫水機、包埋機、切片機和生物顯微鏡等設(shè)備為德國Leica公司產(chǎn)品，微量組織勻漿器為Millipore公司產(chǎn)品，ZH藍(lán)星C/s型腦立體定位儀，高氯酸、乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2)均為分析純，甲醇為色譜純，對照品由中國藥品生物制品所提供。
14模型復(fù)制參考Wakata[3]的方法，將亞氨基二丙腈溶解于生理鹽水，稀釋成濃度100mg/mL，給藥途徑為腹腔注射，劑量為150mg·kg-1·d-1，每天1次，共用7d。
15分組及給藥選用SD大鼠隨機分為4組：空白組和模型組各10只，中藥組和西藥組各20只，每組均雌雄各半。治療組在造模后第2天開始給藥，中藥組按20kg的兒童每天口服20mL益智寧神口服液的比例計算，每只大鼠灌胃約2mL/d;西藥組按20kg的兒童每天口服氟哌啶醇片1mg的比例計算，每只大鼠灌胃約015mg/d，連續(xù)14d。
16大鼠行為觀察[4]采用觀察評分，每次至少觀察1h，主要誘發(fā)癥狀為運動行為和刻板運動。(1)運動行為評分：0分：安靜或正常活動;1分：能過度興奮;2分：探究行為增加;3分：跑;4分：跑和跳;(2)刻板運動(或定型運動)評分：0分：無刻板運動;1分：旋轉(zhuǎn)行為;2分：頭和頸部的上下運動過多;3分：頭、頸部的上下運動過多加旋轉(zhuǎn)行為;4分：頭向側(cè)擺合并頭和頸部的上下運動過多。
17神經(jīng)遞質(zhì)水平檢測[5]第14天將所有實驗大鼠迅速斷頭處死，借助腦立體定位儀，取右腦海馬組織及邊緣系統(tǒng)(包括紋狀體、隔核、層殼核、基底節(jié)、齒狀回)，精確稱質(zhì)量，置入1mL處理液(含01mol/L高氯酸和05g/LEDTANa2)中，微量組織勻漿器冰溶下勻漿，4℃冰凍離心10000r/min，取上清液置入-20℃保存。采用高效液相色譜法測定多巴胺(DA)和去甲腎上腺素(NE)濃度。測樣時，室溫下解凍，進樣20μL，以峰面積外標(biāo)法定量。
18統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS130和SAS913版本進行統(tǒng)計學(xué)處理和分析，各組神經(jīng)遞質(zhì)水平檢測數(shù)據(jù)分別進行方差齊性和正態(tài)分布檢驗，方差不齊采用秩和檢驗，檢驗水平α=005。
2結(jié)果
21各組行為學(xué)觀察和評分各組治療前后運動行為和刻板運動積分見表1。模型組行為學(xué)評分與空白組比較，差異有顯著性意義(P
治療14d后，中、西藥組運動行為積分和刻板運動積分降低，與模型組比較差異有顯著性意義(P
22各組治療前后腦組織DA、NE含量變化比較表2結(jié)果顯示：模型組腦組織DA水平降低，NE水平升高，與空白組比較差異均有顯著性意義(P
3討論
IDPN是一種中樞神經(jīng)毒素，50年代以后就用于神經(jīng)病理學(xué)的研究，本研究參考Wakata[3]的方法復(fù)制模型，從神經(jīng)生物學(xué)和行為學(xué)兩方面觀察藥物治療對TS模型動物臨床行為學(xué)典型特征的影響。IDPN誘發(fā)TS模型大鼠出現(xiàn)明顯刻板運動和運動行為異常，如過度興奮、探究行為、異常跑跳、旋轉(zhuǎn)行為和頭頸部上下側(cè)擺等動作均具有TS臨床行為學(xué)的典型特征，有時出現(xiàn)連續(xù)的嗤鼻、抬舉上肢等動作，類似于人類TS患兒喉部發(fā)聲、聳肩等特征行為。本研究通過對藥物治療前后TS模型大鼠運動行為和刻板運動行為評分的比較，發(fā)現(xiàn)中藥組在改善動物TS典型特征行為方面效果明顯，如頭部、頸部的抽動減輕，旋轉(zhuǎn)行為明顯緩解，每次異常行為發(fā)作持續(xù)時間縮短，異常抽動次數(shù)消失，異常跑動及不規(guī)律的彈跳運動明顯減少。
雖然目前對TS的神經(jīng)生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)還未完全闡明，但基本認(rèn)為中樞神經(jīng)遞質(zhì)，特別是DA、NE、5-羥色胺(5HT)等與TS之間關(guān)系密切[5]，因此，探討大腦多巴胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的水平是證明藥物神經(jīng)生物學(xué)療效的主要依據(jù)。本研究對大腦海馬區(qū)DA和NE水平進行測定，結(jié)果表明：治療后中藥組DA水平明顯升高，而NE水平有所下降，均趨向于正常水平。與TS有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)包括乙酰膽堿、腎上腺素、5HT、多巴胺等，主要分布于紋狀體、隔區(qū)、藍(lán)斑、黑質(zhì)等海馬、基底前腦及邊緣系統(tǒng)，構(gòu)成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[6-8]。有關(guān)藥物治療對大腦組織不同部位和核團神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響文獻報道并不一致，而且與檢測時間點有很大關(guān)系[8]。本研究結(jié)果初步表明，中藥治療14d后，對大腦組織DA和NE兩種神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化產(chǎn)生顯著影響，對于治療過程中以及停藥后神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)變化仍需進一步觀察。
益智寧神口服液的主要組成為：熟地黃、黃芪、白芍、龍骨、遠(yuǎn)志、石菖蒲、五味子。其中熟地，其味甘，性微溫，入心、肝、腎經(jīng)，本品味厚氣薄，為補血生精、滋陰補腎之要藥，《珍珠囊》曰：“主補血氣，滋腎水，益真陰”。黃芪，味甘，性微溫，入脾、肺經(jīng)，質(zhì)輕升浮，為升陽補氣之圣藥。可補中氣、益元氣、溫三焦、壯脾陽，選以補脾益氣。白芍味苦、酸，性微寒，入肝經(jīng)，既能養(yǎng)血斂陰，又能平抑肝陽，還能柔肝止痙;而龍骨味甘、澀，性微寒，入心、肝經(jīng)，專攻平肝潛陽、鎮(zhèn)靜安神之用，兩者搭配，養(yǎng)陰寧心，平肝潛陽。五味子性溫，五味具備，酸能收斂，苦能清熱，咸能滋腎，溫而不燥，既能益氣生津，補腎養(yǎng)心，用其養(yǎng)心滋腎安神;遠(yuǎn)志、石菖蒲有安神益智、化痰開竅之功效。諸藥配伍，具有健脾滋腎、平肝熄風(fēng)、寧神益智、化痰開竅之功效。氟哌啶醇是目前治療TS的最有效藥物之一[9]，療效確切，但因副作用明顯使其臨床應(yīng)用受到限制，通過實驗結(jié)合臨床用藥發(fā)現(xiàn)，益智寧神口服液的療效與氟哌啶醇無明顯差異，且療效更加穩(wěn)定，易為患兒及家屬接受。
參考文獻
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關(guān)鍵詞：慢性疲勞綜合征 慢性束縛
Chronicity weary synthesis drafts the big mouse to make mold two method comparison
Mei Rongjun Wei Xiaoli
Abstract:Objective:Discusses the barrel fetter law to send the big mouse chronicity with the fetter law to make the mold wearily the comparison. Methods:30 male Wistar big mice divide into the barrel fetter group stochastically,puts up the fetter group and the control group,each group of each 10,use the chronic fetter the way to establish the big mouse chronicity weary synthesis to draft the model,observes each group of big mouses strength to use up the swimming experiment. Results:The barrel fetter group compares the fetter group big mouses behavior study target closer chronicity state of fatigue,also the death quantity are few. Conclusion :Establishes the more ideal chronic weary animal model support fetter law to surpass the barrel fetter law.
Keywords:The chronic weary synthesis drafts The chronic fetter
【中圖分類號】R-3 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】1008-1879(2010)12-0002-01
本課題組［1］確立較為理想的動物模型是研究CFS的基礎(chǔ)，本觀察通過對兩種常見慢性束縛造模方法的比較，尋找更合理的造模方法。
1 材料與方法
1.1 材料。
1.1.1 動物。健康雄性Wistar大鼠30只,清潔級,體重160g~200g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。動物飼養(yǎng)環(huán)境:清潔級實驗室飼養(yǎng),溫度20℃~28℃,濕度35%~70%,噪聲
1.1.2 主要儀器及造模用具。儀器：水迷宮（研究室設(shè)備）。桶束縛法:用硬塑料瓶特制束縛筒，管狀,長18 cm直徑5.2 cm,其瓶口為通氣口。大鼠頭向通氣口置入后,調(diào)節(jié)封口束縛大鼠活動空間。大鼠束縛架：為木制，底座寬10cm、長20cm、厚1cm，四角鐵釘、大鼠四肢捆綁彈力帶。
1.2 方法。
大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后,隨機分為桶束縛組、架束縛組與正常組，每組10只，10只/籠,自由進食飲水。造模期間,桶束縛組與架束縛組每天各束縛1次,晚上六點開始。束縛時,使桶束縛組大鼠鉆進束縛筒內(nèi),調(diào)節(jié)到其不產(chǎn)生強烈反抗的緊張程度,平放在大鐵臺上。將架束縛組大鼠束縛于特制的鼠束縛架上。桶束縛時間為4小時，架束縛時間為3小時。束縛過程中,正常組動物在同一環(huán)境,不予以進食水。造模2周，桶束縛組死亡2只。結(jié)束后,立即開始行為學(xué)的測定。
2 力竭游泳實驗觀察
3組動物均于造模前一天及造模的第14天(造模最后1d)進行,記錄大鼠從入水到游泳至力竭的時間(2次游泳法,取均值)。力竭游泳時水深為50cm、水溫(28±1)℃,將事先標(biāo)記好的大鼠同時置入游泳池,記錄大鼠從入水到游泳至力竭(頭部沉入水中10秒中不能浮出水面為力竭標(biāo)準(zhǔn))的時間。
3 結(jié)果
本觀察選擇力竭游泳實驗評定動物模型,造模后架束縛組大鼠力竭游泳時間時間明顯減少,與正常組對比有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(*P
[關(guān)鍵詞] 阿爾茨海默病; 胰高血糖素樣多肽1; 鏈尿佐菌素
[中圖分類號] R749.16 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)07-07-03
Protection of GLP-1 on STZ-induced Dementia Rat Model in Morris Water Maze Behavior
ZHANG Zhifeng1 LI Lin2 GAO Ying2 ZHU Baozhong2
1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Geriatrics Institutes,the College of Basic Medicine of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
[Abstract] ObjectiveTo study protective effect of GLP-1(glucagon-like peptide-1) on behavior and pathology in Alzheimer disease(AD)rats induced by streptozocin(STZ). MethodsTwenty-four rats were randomly divided into three groups:control group,AD model group and GLP-1 protection group. The control group received intracerebroventricular injection of saline. The AD model group received intracerebroventricular injection of STZ,and the GLP-1 protection group received intracerebroventricular injection of STZ plus GLP-1. The capacity of learning and memory of the rats was detected by Morris water maze. ResultsIn Morris water maze place navigation test,the escape latency of the AD model group was longer than that of the control group and GLP-1 protection group each day(P
[Key words]Alzheimer disease; Glucagon-like peptide-1; Streptozocin
阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進行性的退行性疾病。其病因?qū)W和發(fā)病機制極其復(fù)雜,其中糖代謝病因紊亂學(xué)說在近年來備受關(guān)注。2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)和AD共同的病因?qū)W顯示出相同治療技術(shù)的可能性[1]。AD最賦特征性的病理學(xué)改變是β-淀粉樣肽(β-amyloid peptide,Aβ)聚集而成的老年斑;腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白異常磷酸化誘導(dǎo)的神經(jīng)纖維纏結(jié)。
STZ一般是用來誘導(dǎo)T2DM實驗動物模型的[2],但由于其能誘導(dǎo)多種AD病理學(xué)變化,所以也可被用于誘導(dǎo)AD實驗動物模型[3]。而GLP-1是一種由36～37個氨基酸組成的內(nèi)源性胰島素樣腸肽,具有血糖調(diào)節(jié)作用,且已有多種長效GLP-1商品劑型應(yīng)用于臨床治療T2DM[4]。研究還顯示GLP-1具有神經(jīng)保護和抑制Aβ表達(dá)的作用[5-7],提示GLP-1可能成為防治AD的藥物。在本研究,我們用STZ誘導(dǎo)實驗動物腦損傷,同時用GLP-1進行治療,以實驗動物Morris水迷宮行為學(xué)變化為觀察指標(biāo),來初步研究GLP-1對STZ誘導(dǎo)的AD樣實驗動物腦損傷的保護作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
雄性Wistar 大鼠24只(由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供),體重(250±10)g,隨機分為對照組、AD模型組和GLP-1保護組,每組8只。
1.2 實驗動物模型
動物禁食不禁水12h后,10%水合氯醛(3mL/kg)腹腔麻醉,立體定位儀固定,側(cè)腦室注射定位:前囟后1.0mm、矢狀縫側(cè)1.5mm處,深度3.5mm。AD模型(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)組注射STZ(3mg/kg,10μL)[3];對照組注射10μL的生理鹽水;GLP1保護組注射10μL STZ半小時后再注射((Val8)GLP-1(一種長效GLP-1,10μL(Val8)GLP-1,50μM,由英國Dr.Christian H?lscher實驗室贊助)[9]。每次注入時間為10min,留針5min,緩慢出針。在第1、3天注射,共2次。
1.3 Morris水迷宮檢測
術(shù)后3周進行Morris水迷宮行為學(xué)測試[3]。Morris水迷宮是由一圓柱形不銹鋼水池、一可移動的平臺和一套圖像自動采集、處理系統(tǒng)等組成。水池直徑150cm,高70cm;平臺直徑15cm,高40cm。實驗內(nèi)容包括定位航行實驗(連續(xù)5d,每天上、下午各2次)和空間探索實驗(第6天進行,上、下午各1次)。定位航行實驗是用大鼠在水中尋找平臺的逃避潛伏期來檢測大鼠的學(xué)習(xí)能力;空間探索實驗(取走平臺后)則是通過原平臺象限游泳時間與總時間之比來測試大鼠的記憶能力。我們設(shè)定,每次定位航行的時間最長為120s,當(dāng)大鼠在120s內(nèi)找到平臺后可停留10s;每次空間探索的時間也是120s。
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法
結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組均數(shù)間的比較使用的統(tǒng)計方法是重復(fù)測量方差分析和單因素方差分析,兩兩比較采用Bonferroni檢驗,且均是用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件來處理。P
2 結(jié)果
GLP-1對AD模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。定位航行實驗示,各天AD模型組分別與對照組和GLP-1保護組大鼠相比,其逃避潛伏期明顯延長,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P
空間探索實驗示,對照組、GLP-1保護組與AD模型組相比,其在原平臺象限的時間比例明顯都比AD模型組大,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P
3 討論
直接用GLP-1來進行實驗有一缺陷就是其半衰期短,所以我們就選用了Christian H?lscher教授提供給我們的(Val8)GLP-1作為GLP-1的替代物來進行此實驗。
有關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)與神經(jīng)電生理研究顯示,GLP-1有抗Aβ、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護作用[5-7],但無研究GLP-1在動物行為學(xué)作用的報道。所以本實驗采用了Morris水迷宮實驗技術(shù),來檢測GLP-1對STZ所誘導(dǎo)的AD模型大鼠在Morris水迷宮中行為學(xué)的作用。
Morris水迷宮是英國心理學(xué)家Morris于20世紀(jì)80年代初設(shè)計并應(yīng)用于腦學(xué)習(xí)記憶機制研究的一種實驗手段,其在AD研究中的應(yīng)用非常普遍[3]。較為經(jīng)典的Morris水迷宮,測試程序主要包括定位航行試驗和空間探索試驗兩個部分。其中定位航行試驗(place navigation)歷時數(shù)天,每天將大鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中若干次,記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的時間(逃避潛伏期,escape latency)。空間探索試驗(spatial probe)是在定位航行試驗后去除平臺,然后任選一個入水點將大鼠放入水池中,記錄其在一定時間內(nèi)的游泳軌跡,考察大鼠對原平臺的記憶[12]。
我們的Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示,在定位航行實驗中,5天里AD模型組的逃避潛伏期均比另兩組的長,而且GLP-1保護組與對照組的逃避潛伏期基本上無差異,這不僅提示造模是成功的,而且也提示GLP-1對STZ所誘導(dǎo)的癡呆大鼠的損傷在學(xué)習(xí)功能方面有一定的保護作用。但是在第3天的實驗中,GLP-1保護組的潛伏期(28.1±2.3)s與對照組的(22.0±1.8)s有差異(P=0.02),這提示GLP-1雖對STZ所誘導(dǎo)的癡呆大鼠的損傷在學(xué)習(xí)功能方面有一定的保護作用,但未完全達(dá)到正常水平。在空間探索實驗里,也得到類似于上面的結(jié)果。
綜上所述,GLP-1對鏈尿佐菌素誘導(dǎo)的癡呆大鼠在Morris水迷宮中的行為學(xué)方面是有明顯保護作用的。
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【關(guān)鍵詞】老年癡呆 行為學(xué)指標(biāo) 腦內(nèi)有關(guān)物質(zhì)含量檢測指標(biāo) 腦組織形態(tài)學(xué)觀察指標(biāo) 血液檢測指標(biāo)
中圖分類號：R592文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1005-0515（2010）12-030-03
【ABSTRACT】Objective To sum up and appraisal the evaluating indicators and methods of treating senile dementia. Methods Former indicators were summarized from four aspects of the behavior indicator, the examination indicator of related material content in brain, the brain tectology observation indicator and the blood examination indicator and other indicators were carried on the forecast. Results Through the discussion of drug efficacy targets and the methods,it provides newly and important data for the senile dementia mechanism and the treatment research. Conclusion There is a very important significance to find the effective mathods to prevent and treat the senile dementia by intensively studing main evaluating indicators and methods of treating senile dementia .
【KEY WORDS】Senile dementia; Behavior indicator; Examination indicator of related material content in brain; Brain tectology observation indicator ; Blood examination indicator
眾所周知，人類社會己經(jīng)逐漸進入老齡化社會，老年癡呆已成為威脅人類晚年身心健康的主要疾病之一，患病率呈逐年上升趨勢。資料顯示，研究者已針對腦的結(jié)構(gòu)、功能和信息傳遞的新認(rèn)知開發(fā)出了許許多多的治療藥物，且防治效果顯著，但相關(guān)藥效評價指標(biāo)多散在于浩如煙海的文獻中，為此本文總結(jié)相關(guān)文獻，從行為學(xué)指標(biāo)、腦內(nèi)有關(guān)物質(zhì)含量檢測指標(biāo)、腦組織形態(tài)學(xué)觀察指標(biāo)、血液檢測指標(biāo)四個方面對藥物治療老年癡呆進行藥效評價，為老年癡呆機理和治療的研究提供新的、重要的數(shù)據(jù)源。
1 行為學(xué)指標(biāo)
1.1 水迷宮指標(biāo)
20世紀(jì)80年代初，Morris發(fā)明了水迷宮，它是一種測量空間學(xué)習(xí)和記憶能力的實驗方法，可用來評估嚙齒動物由于老年癡呆等因素所造成的學(xué)習(xí)記憶的影響，目前已被認(rèn)為是此類研究的經(jīng)典。
Morris水迷宮實驗由兩個主要的實驗組成，分別是定向航行實驗和空間探索實驗。
定向航行實驗時，將動物從之前劃分好的四個象限中隨機放入，在最大游泳時間內(nèi)，可以記錄并作為評價指標(biāo)的主要是逃避潛伏期（指大鼠自進入迷宮開始至找到平臺所需的時間，經(jīng)典的水迷宮實驗以此作為主要指標(biāo)進行統(tǒng)計分析），除此之外還有游泳路程長度（指大鼠自進入迷宮開始至找到平臺游過的總距離。它是逃避潛伏期和平均游泳速度的乘積，是一個綜合指標(biāo)，受兩者共同的影響，既可以反映大鼠對平臺位置的學(xué)習(xí)記憶能力，又反映了大鼠的運動能力）、游泳速度（指大鼠進入水迷宮運動的快慢，速度的快慢，一般并不反映大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，僅反映大鼠的游泳能力。但在某種程度上，大鼠的逃避潛伏期短，那么相對消耗的體力也會少，速度也可能會較快。速度較快，那么，行程也可能會較長）、入水角度（指大鼠進入水迷宮后開始運動的方向與入水點和平臺連線的夾角。如果與逃避潛伏期結(jié)合分析，在某種程度上可以彌補單純考慮時間的不足）、搜索策略等可作為評價指標(biāo)的補充，在分析過程中起參考作用，這個實驗主要用于評價動物的空間學(xué)習(xí)能力。對于最大游泳時間，各實驗人員有不同看法，通常選擇 120s，90s或60s。最大游泳時間會在統(tǒng)計中由于個別動物而影響整組數(shù)據(jù)，特別是選擇較大的游泳時間時，因此，應(yīng)該在實驗前做好動物的篩選工作，并在統(tǒng)計數(shù)據(jù)時去掉異常值。
定向航行實驗進行幾天后（按動物學(xué)習(xí)情況定），開始空間探索實驗，將平臺撤去，一般探索時間在90s或60s內(nèi)[2]，可以記錄并作為評價指標(biāo)的主要有尋求原平臺的次數(shù)（也就是跨平臺次數(shù)：是在撤去平臺后，動物穿越原平臺所在位置的次數(shù)，反應(yīng)動物尋找平臺的能力，與原平臺象限停留時間結(jié)合起來考慮更能反應(yīng)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的變化）、原平臺象限的游泳時間，原平臺象限游泳時間占總時間百分比，這個實驗主要用于評價動物的空間記憶能力。
水迷宮實驗作為老年癡呆動物的評價指標(biāo)來說充分而又準(zhǔn)確的，是最常用的評價治療老年癡呆藥效的指標(biāo)，但是它也有不足之處，Graziano [3]認(rèn)為簡單地使用目前常用的觀測指標(biāo)不能準(zhǔn)確的反映真實的搜索策略，于是選擇了一些自定義的行為種類、大量的數(shù)值變量和重要區(qū)域，使用判別式分析的方法來獲得較高的準(zhǔn)確率。Graziano的這種方法雖然準(zhǔn)確但是種類繁多比較復(fù)雜，所以我們進行日常實驗時，只要選擇主要的評價指標(biāo)補充幾個次要指標(biāo)就可以清楚地反映實驗的結(jié)果了。
1.2 跳臺實驗指標(biāo)
跳臺實驗是藥理學(xué)常用的評價動物對藥物及其他給予的干預(yù)后的神經(jīng)行為學(xué)中一個測試現(xiàn)象較為明顯的實驗，也就是測量大小鼠記憶能力的變化的實驗。跳臺實驗指標(biāo)是評價藥效常用的指標(biāo)之一，從文獻的記錄中看實屬完善成熟。
檢測方法：將大鼠或小鼠放入跳臺儀內(nèi)適應(yīng)環(huán)境,然后通電,大多數(shù)跳上跳臺逃避電擊。從通電到完全穩(wěn)定上臺所用的時間為潛伏期,跳下時大鼠雙足同時接觸銅柵視為錯誤反應(yīng),訓(xùn)練并記錄訓(xùn)練時間內(nèi)的潛伏期和錯誤次數(shù)作為學(xué)習(xí)指標(biāo)。24h后重測,先將大鼠或小鼠放在跳臺上,記錄第1次跳下跳臺時間為潛伏期,并記錄錯誤次數(shù)作為記憶能力指標(biāo)。
2腦內(nèi)有關(guān)物質(zhì)含量檢測指標(biāo)
老年癡呆發(fā)病機制復(fù)雜，多種信號通路參與此過程，許多信號分子在其中發(fā)揮重要作用[4]。目前已公認(rèn)，學(xué)習(xí)記憶與中樞膽堿神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系極為密切。研究還表明，患者的癡呆程度與皮質(zhì)和海馬中信號分子的缺失程度密切相關(guān)，在患者腦中，基底前腦的膽堿能神經(jīng)細(xì)胞明顯丟失，膽堿能神經(jīng)纖維發(fā)生退變，AchE、谷氨酸、p-KER2等在腦內(nèi)的表達(dá)出現(xiàn)異常，尤以皮質(zhì)和海馬顯著。
2.1 膽堿酯酶（AchE）活性的檢測
膽堿酯酶是膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的水解酶直接參與自主神經(jīng)功能調(diào)節(jié)、肌肉運動、大腦思維記憶等重要功能。研究證實老年癡呆患者中樞膽堿能系統(tǒng)損傷，AchE活性和突觸前膽堿能標(biāo)志在多處腦區(qū)均顯著降低或缺失患者基底前腦區(qū)膽堿能神經(jīng)元丟失，從基底節(jié)到皮質(zhì)，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性降低和乙酰膽堿酯酶(AChE)活性明顯升高，造成乙酰膽堿 (ACh)的合成、儲存和釋放減少，皮質(zhì) ACh受體數(shù)目減少，產(chǎn)生癡呆癥狀 [5]。總的來說，老年癡呆患者腦組織中膽堿乙酰化酶活性明顯降低，膽堿酯酶活性顯著升高，造成 ACh含量不足，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能下降，甚至智力喪失[6]。因此AchE活性的檢測作為評價老年癡呆藥效的主要指標(biāo)，且在藥效評價中的使用甚為頻繁。
檢測方法：斷頭法處死實驗動物后，迅速取腦，用預(yù)冷的生理鹽水沖凈表面血液，用濾紙吸干，去除軟腦膜血管。取右腦稱重，置微型勻漿器中，加無水乙醇研磨，再加生理鹽水充分研磨制成勻漿。冷凍離心機離心，取上清液。用羥胺比色法測定AChE活性(可按照試劑盒說明書進行操作)。
2.2 谷氨酸含量的測定
谷氨酸是腦內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，介導(dǎo)興奮性突觸傳遞，并與長時程增強（long term potentiation LTP）的形成密切相關(guān) [7]，也作為老年癡呆藥效的相關(guān)評價之一。
檢測方法：在海馬組織中加入HCL溶液，冰浴下超聲勻漿，低溫離心，取上清液加入正亮氨酸為內(nèi)標(biāo)物，利用異硫氰酸苯酯衍生，用內(nèi)標(biāo)法測定谷氨酸含量[8]。
2.3 p-KER2含量的測定
p-KER2含量測定：將海馬組織放到預(yù)冷的裂解液中。低溫超聲粉碎后，離心，取上清液分裝。用Braford法測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。用磷酸化抗體，常規(guī)Western蛋白印跡法測定p-KER2含量[9]。掃描蛋白條帶，進行吸光度分析，吸光度值代表p-KER2含量。
2.4 Aβ和S.P含量的測定
Aβ由分泌酶水解β淀粉樣前體蛋白產(chǎn)生，稱為β-淀粉樣肽，Aβ生成的增多對神經(jīng)元有毒性作用[10]，大腦海馬組織形態(tài)也發(fā)生明顯的變化。而Aβ被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及認(rèn)知功能衰退的主要致病物質(zhì)[11]。
S.P是世界上發(fā)現(xiàn)最早的神經(jīng)肽，研究表明，S.P與學(xué)習(xí)記憶功能有關(guān)，且對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用，向人們提示了其對老年性癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有潛在的防治價值[12]。
因此Aβ和S.P含量的測定對藥效的評價有著重要的作用。
2.5 皮質(zhì)的蛋白含量的測定
檢測方法：分離腦皮質(zhì)，稱重，組織加入磷酸鹽緩沖液（PBS）液，在組織勻漿器中充分研磨后，離心，吸取上清液，用PBS按1:4的比例配成組織勻漿液。最后用酶標(biāo)儀微量比色法測定皮質(zhì)勻漿液的蛋白含量。
3 腦組織形態(tài)學(xué)觀察指標(biāo)
3.1 海馬病理形態(tài)觀察
海馬組織主要負(fù)責(zé)存儲信息,是人學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵部位。海馬結(jié)構(gòu)的整合是空間學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)，海馬區(qū)的受損影響大鼠學(xué)習(xí)行為的實驗結(jié)果，和臨床患者健忘、癡呆等表現(xiàn)是一致的[13] 。海馬萎縮被看成是與記憶損傷相關(guān)的重要指標(biāo)，也是評價藥效的主要指標(biāo)之一。
檢測方法：斷頭處死，開顱取出完整的腦組織，用10%的福爾馬林固定，切取腦組織，石蠟包埋，連續(xù)切片，行HE常規(guī)染色，進行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。
3.2 檢測海馬及邊緣系統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)元丟失狀況
老年癡呆患者的病理學(xué)特征是大量神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)、細(xì)胞外老年斑和彌漫性腦萎縮[14]。計算神經(jīng)元數(shù)目檢測海馬及邊緣系統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)元丟失狀況可以直觀簡單地推測出患者的生理狀態(tài)，是評價藥效的重要指標(biāo)。
3.3 病理組織切片及免疫組織化學(xué)染色
病理組織切片及免疫組織化學(xué)染色只要在光學(xué)顯微鏡下，老年癡呆動物模型內(nèi)部結(jié)構(gòu)的病理變化就一目了然，從而透徹地解析老年癡呆的病因和發(fā)病機制。
檢測方法：開顱取腦后固定、脫水等過程后，進行冠狀冷凍切片。切片PBS沖洗，經(jīng)過溶于 PBST進行過氧化反應(yīng)，封閉處理后，加入鼠抗搖勻、孵育過夜。然后，在室溫下加入生物素化羊抗鼠IgG搖勻、孵育，室溫?fù)u勻、孵育，顯色。最后，經(jīng)過常規(guī)粘片、干燥、脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝。
4 血液檢測指標(biāo)
近年來的研究表明，血液指標(biāo)的檢測不僅可預(yù)測患上老年癡呆的風(fēng)險，其準(zhǔn)確率高達(dá)90%，還可以作為不可或缺的藥效評價指標(biāo)，專家認(rèn)為，血液檢測有望為人類防治老年癡呆癥帶來革命性變化。
4.1 血清β淀粉樣蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子及類胰島素樣生長因子Ⅱ水平檢測
分泌酶水解β淀粉樣前體蛋白產(chǎn)生Aβ,而Aβ又是導(dǎo)致認(rèn)知功能衰退的主要致病物質(zhì)，所以老年癡呆伴有β-淀粉樣蛋白沉積，可通過檢測血清β淀粉樣蛋白的水平來估計Aβ的含量。
檢測方法：取血分離血清,血清β淀粉樣蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子及類胰島素樣生長因子Ⅱ檢測采用放免法。
4.2 超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)羥自由基的含量檢測
檢測方法：快速開胸，心臟取血，離心取血清，置于低溫保存，按試劑盒說明書，紫外分光光度法檢測超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)羥自由基的含量觀察動物腦組織形態(tài)學(xué)的病理變化。
4.3 血液流變學(xué)檢測
研究表明，血液流變學(xué)異常是導(dǎo)致血液成分改變的主要因素之一。有研究認(rèn)為，高黏血癥是癡呆的危險因素之一。其機制可能與血液黏滯度異常則血流變慢，血液黏稠度增加而致腦血流量下降，腦部缺血缺氧，損害大腦的學(xué)習(xí)記憶功能有關(guān)[15]。血液流變學(xué)檢測也可以評價藥物療效的好壞。
5 小結(jié)
到目前為止，各種藥效評價指標(biāo)層出不窮，除了上述常用的指標(biāo)外，按照每種治療方法或者藥物對此疾病改善的不同，檢測的指標(biāo)也會有所不同，如晚期老年癡呆存在嚴(yán)重氨基酸代謝障礙，腦脊液，血漿中興奮性氨基酸谷氨酸、天門冬氨酸含量的測定具有重要價值；老年癡呆能引起nNOS和NO表達(dá)增加，而MTPG(代謝型谷氨酸受體阻斷劑α-甲基-（4-四唑基-苯）甘氨酸能阻斷老年癡呆誘導(dǎo)的nNOS表達(dá)增加[16]，因此nNOS含量的檢測在MTPG這種受體阻斷劑的影響下有相對重要的意義等。還有血糖指標(biāo)，海馬顳葉中D2受體變化、載脂蛋白E的含量等等都與老年癡呆的機理息息相關(guān)，由于這些指標(biāo)多而雜是近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，還未得到廣泛的應(yīng)用及證實，還未成熟，故本文只選取了一些成熟、常用、重要且有效的指標(biāo)及其檢測方法進行整理歸類，為以后的研究提供更方便的查找途徑，但是歸類的指標(biāo)中也還很多細(xì)節(jié)到現(xiàn)在為止還沒有透徹，值得進一步研究、完善，使其更加適用于老年癡呆的機制探討和藥理研究。
這些評價指標(biāo)的整理與總結(jié)以老年癡呆藥理學(xué)的研究為基礎(chǔ)，以評價藥效為目的，從而為多層次、多角度深入研究老年癡呆的發(fā)病機理奠定了基礎(chǔ)，為藥物治療老年癡呆提供更多的途徑，有利于進一步提高藥物治療老年癡呆的療效以及臨床價值，并為研究開發(fā)療效更高、毒性更小的治療老年癡呆的藥物提供更多思路。
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【摘要】
目的：觀察大鼠急性脊髓損傷后大劑量甲基強的松龍（methylprednisolone，MP）沖擊療法對大鼠骨密度及生物力學(xué)的影響。方法: 46只成年健康SD大鼠隨機分為對照組、模型組、治療組等3組。按改良Allen's法建立大鼠急性脊髓損傷模型。治療組傷后 30min 經(jīng)腹膜腔注入MP30mg／kg，以后每小時注入 MP5.4mg／kg，維持24h；模型組應(yīng)用生理鹽水替代 MP，處理方法同治療組。觀察模型組與治療組大鼠在傷后1、3和6個月 BBB 運動功能評分、各組L4椎體、股骨不同部位骨密度及生物力學(xué)參數(shù)的變化。結(jié)果: 術(shù)后各時間點模型組與治療組BBB 評分總體呈增高趨勢，治療組在各個時間點BBB 神經(jīng)行為學(xué)評分均優(yōu)于模型組（P
【關(guān)鍵詞】 急性脊髓損傷；甲基強的松龍；骨質(zhì)疏松；骨密度；生物力學(xué)
［ABSTRACT］ Objective: To investigate the effect of high dose MP on bone density and biomechanics changes after acute spinal cord injury（ASCI）．Methods: A total of 46 adult rats were randomly pided into three groups， namely， the control group (CG)， the model group (MG)， and the experimental group (EG). After anesthesia， T8 vertebrae plate resection were performed to rats in both CG and EG with spinal cords injury by Allen method. Thirty minutes after ASCI， the subjects in experimental group received MP injection through intraperitoneal with dosage of 30 mg/kg. Then a dosage of 5.4 mg/kg of MP was given through intraperitoneal injection every hour in 24 hours. The subjects in the model group received normal saline instead of MP with the same method. A detection of both Basso， Beattie and Bresnahan (BBB) locomotor rating scaling， bone density and biomechanics was performed to the L4 vertebral body and the femur of rats 1， 3 and 6 months following operation， respectively. Results: BBB scale: after operation， the scale of groups MG and EG was increased over time; group EG was significantly higher than group MG from 1， 3， 6 month (P< 0.05， P
［KEY WORDS］ Acute spinal cord injury；MP；Osteoporosis；Bone density；Biomechanics
急性脊髓損傷（acute spinal cord injury，ASCI）是一種嚴(yán)重的損傷，其病死率、致殘率很高。傷后大劑量甲基強的松龍（methylprednisolone，MP）沖擊是目前急性脊髓損傷公認(rèn)治療方法，它的作用機制復(fù)雜。甲基強的松龍早期可以顯著增加神經(jīng)系統(tǒng)興奮性，改善脊髓血流量，減輕組織損傷［1，2］，但其遠(yuǎn)期對患者的影響不明確。筆者以通過改良Allen’s法［3］建立大鼠脊髓損傷動物模型，研究大鼠脊髓損傷MP治療前、后骨密度及生物力學(xué)改變情況，推測大劑量 MP 治療對患者遠(yuǎn)期療效的影響。
1 材料和方法
1.1 材料
46只雌性 SD 大鼠，體質(zhì)量（250±10）g；4％多聚甲醛 PBS（磷酸緩沖液）固定液；甲基強的松龍注射用粉劑（法瑪西亞普強有限公司）；DPXL型雙能 X 射線骨密度儀（美國Lunar 公司）；858 Mini Bionix 型生物材料力學(xué)實驗機（美國MTS公司）等。
1.2 實驗方法
1.2.1 分組與造模
46只雌性SD大鼠隨機等分為對照組（control group，CG）6只，模型組(model group，MG)20只，治療組（experimental group，EG）20只。造模：將大鼠腹腔麻醉后，常規(guī)消毒，以T8棘突中心作長約3cm切口，暴露硬脊膜，采用改良Allen’s裝置制備脊髓急性打擊傷動物模型，損傷力度為10g×2.5cm。模型制作成功判定標(biāo)準(zhǔn)：打擊后損傷處脊髓出血、水腫，大鼠出現(xiàn)擺尾反射，雙下肢及軀體回縮樣撲動，麻醉清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓。治療組傷后30min 腹膜腔注入MP30mg/kg， 以后每小時注入MP5.4mg/kg，連續(xù)注射24h。 模型組以生理鹽水替代MP，按治療組同樣方法給藥。致傷后每日按壓大鼠膀胱促進排尿，定時喂食。
1.2.2 神經(jīng)行為學(xué)評分
評分觀察者為非本試驗組員。在損傷后1、3、6個月參照 BBB(basso beattie bresnahan locomotor rating scale，BBB) 神經(jīng)行為學(xué)評分法［4］綜合評定MG組和EG 組的功能。最小值為 0 分，表示神經(jīng)行為功能完全喪失；最大值為 21 分，表示行為功能完全正常。
1.2.3 骨密度及生物力學(xué)檢測
分別于術(shù)后1、3、6個月，在麻醉狀態(tài)下對各組大鼠用雙能X射線骨密度儀的小動物測量軟件測定右股骨、腰4椎體的骨密度。術(shù)后6個月處死大鼠后取各組大鼠的右側(cè)股骨及腰4椎體，去除表面附著軟組織，用生理鹽水浸濕的紗布包裹后置于20℃冰箱保存。力學(xué)檢測前室溫解凍標(biāo)本，使用生物材料力學(xué)實驗機進行股骨3點彎曲和腰椎結(jié)構(gòu)強度實驗。股骨3點彎曲實驗跨距2mm，加載速度為2mm/min，腰椎結(jié)構(gòu)強度實驗加載速度為1mm/min，勻速加載直至標(biāo)本斷裂。每個樣本放置在儀器上的位置及方向保持一致。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理
采用 SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗，P
2 結(jié)果
2.1 動物一般情況
模型組和治療組造模后，大鼠雙側(cè)下肢癱瘓，模型組及治療組各有5只在造模1個月內(nèi)死亡，模型組有1只在第60天死亡，故均未列入統(tǒng)計。
2.2 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分
治療組在1、3、6個月 BBB 神經(jīng)行為學(xué)評分均優(yōu)于模型組，兩組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05，P < 0.01)，見表1。 表1 各組大鼠脊髓損傷后后肢功能 BBB 評分 （略）
2.3 各組骨密度測定
術(shù)后1、3、6個月，模型組及治療組大鼠右側(cè)股骨、第4腰椎骨密度明顯下降，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05，P
2.4 各組大鼠股骨3點彎曲和腰椎結(jié)構(gòu)強度測定
術(shù)后6個月，模型組及治療組大鼠右側(cè)股骨、第4腰椎骨結(jié)構(gòu)強度均顯著降低，與對照組相比有極顯著性差異(P
3 討論
海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報 Vol.16 No.7 Jul.2010ASCI是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。目前臨床治療急性脊髓損傷均按全美急性脊髓損傷隨機受控臨床試驗的方案進行治療。糖皮質(zhì)激素藥物MP是目前臨床上用于干預(yù)性治療急性脊髓損傷的首選藥物，其防止繼發(fā)性脊髓損傷的作用機制可能與抑制脂類過氧化有關(guān)物，中和氧自由基，防止神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，促進神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)蘇［1，57］。文獻報道［8］大部分患者都能耐受大劑量MP沖擊治療，部分患者治療時短時間內(nèi)可能出現(xiàn)激素應(yīng)用的不良反應(yīng)，但其對患者的遠(yuǎn)期影響還有待進一步研究。本實驗通過脊髓損傷后模型組與治療組神經(jīng)行為學(xué)評分、骨密度及生物力學(xué)的測定，對2組骨大鼠骨質(zhì)疏松的差異進行分析，了解ASCI早期大劑量應(yīng)用甲基強的松龍對患者的遠(yuǎn)期影響。
本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠神經(jīng)功能受損后隨著時間延長有所恢復(fù)，但比治療組差，大劑量MP可以提高運動和感覺恢復(fù)，特別是不完全脊髓損傷患者，這也與目前臨床應(yīng)用結(jié)果相一致［9，10］。本實驗發(fā)現(xiàn)造模后1、3、6個月，模型組及治療組的骨密度明顯下降，這與國內(nèi)外研究相同［1113］。實驗也發(fā)現(xiàn)造模6個月后，治療組股骨及腰椎的骨密度要低于模型組，具有顯著性差異，這說明大劑量MP遠(yuǎn)期有可能會加快骨質(zhì)疏松的進程。
骨生物力學(xué)反映骨對抗外力作用的強度，集中體現(xiàn)了骨的材料特性和結(jié)構(gòu)特性，骨質(zhì)疏松時由于骨量減少與骨結(jié)構(gòu)的改變，直接影響骨的生物力學(xué)性能，使骨強度降低［14］，增加骨折的危險性。因此，測定骨的生物力學(xué)性能的變化是評價骨質(zhì)疏松癥的一個重要和特殊的指標(biāo)。本實驗發(fā)現(xiàn)術(shù)后6個月，模型組右側(cè)股骨的3點彎曲試驗、第4腰椎壓碎試驗結(jié)果要優(yōu)于治療組，說明大劑量MP對大鼠遠(yuǎn)期骨的生物力學(xué)有影響。
以上結(jié)果表明，早期大劑量MP治療ASCI對于阻止或減少脊髓繼發(fā)損傷，保留脊髓殘存功能，提高患者生存質(zhì)量有重要意義，是治療急性脊髓損傷的一項有效措施，值得進一步的深入研究和應(yīng)用。但大劑量MP治療過程中，有可能加重骨量丟失，加速患者骨質(zhì)疏松的進程，應(yīng)建議患者盡量早期進行各種功能鍛煉，配合預(yù)防骨質(zhì)疏松藥物的長期應(yīng)用，這樣才能提高沖擊療法的安全性和有效性。
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[關(guān)鍵詞] 血管性認(rèn)知障礙；行為學(xué)障礙；康欣膠囊；Morris水迷宮
[中圖分類號] R743 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2011）12（b）-024-03
Study of invigorating kidney and strengthening spleen, nourishing blood and promoting blood method in improving the behavior of rats with vascular cognitive impairment
SHEN Shuanghong1, SHEN Xiaodong2, WU Tongyu1, GONG Degui3, MAO Jingjie1, DU Jian1
1.Research Institute of Traditional Chinese Medicine and Western Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fujian Province, Fuzhou 350108, China; 2.Department of Traditional Chinese Medicine, the Second Hospital of Agricultural Reclamation in Heilongjiang Province, Jiamusi 150007, China; 3.Department of Rehabilitation, the Second People's Hospital of Fujian Province, Fuzhou 350003, China
[Abstract] Objective: To observe the impact of invigorating kidney and strengthening spleen, nourishing blood and promoting blood method on behavior of rats with vascular cognitive impairment (VCI). Methods: 10 rats were chosen randomly as sham operation group before operation, the left rats were caused by the reformed method of lowering blood pressure by clipping two sides of total artery in neck repeatedly combined with Sodium Nitrate of intraperitoneal injection to make vascular cognitive impairment model, which were randomly divided into four groups, namely Kangxin capsule compound group (compound group), Kangxin capsule simplified group (simplified group), western medicine control group and model group, with 10 rats in each group. After treatment for 3 weeks, the escape latency, the times of crossing platform and the learning and memory capacity of the model rats were observed by morris water maze. Results: Compared with model group, the escape latency of rats in Kangxin capsule group, compound group, simplified group and western medicine control group were shortened obviously [(14.57±3.99), (16.93±2.54), (18.42±7.35) s] and the times of crossing platform were increased obviously [(6.90±1.86), (7.20±1.75), (6.10±2.46) times], the differences were significant (P＜0.05). Conclusion: Kangxin capsule made by invigorating kidney and strengthening spleen, nourishing blood and promoting blood can improve behavior of VCI model rats.
[Key words] Vascular cognitive impairment; Behavior impairment; Kangxin capsule; Morris water maze
血管性認(rèn)知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）是由腦血管病危險因素明顯的腦血管病（如腦梗死、腦出血）或不明顯的腦血管病（如白質(zhì)疏松、慢性腦缺血）引起的認(rèn)知功能障礙[1]。采用血管性認(rèn)知障礙的概念，極大地提高對由血管病變或血管危險因素引起的各種認(rèn)知障礙的認(rèn)識，防治癡呆的發(fā)生。既往研究表明，補腎健脾養(yǎng)血活血法治療血管性癡呆取得了良好效果，本研究探討補腎健脾養(yǎng)血活血法立方的復(fù)方中藥對VCI大鼠行為學(xué)障礙的影響，揭示其對VCI的作用機制。
1 材料與方法
1.1 動物與藥物
動物選用6個月齡雄性SD大鼠（購自上海斯萊克實驗動物有限公司），體重為250～300 g，共70只。
復(fù)方中藥康欣膠囊由福建屏山制藥有限公司（批號：900418；規(guī)格：0.3 g/粒）提供。復(fù)方由女貞子、枸杞子、菟絲子、何首烏、黃精、黃芪、羊藿、當(dāng)歸、丹參、丹皮、酸棗仁、、山楂等藥物組成。簡化方由黃芪、羊藿、丹參、當(dāng)歸組成。各組用藥量2.43 g/kg，相當(dāng)于人常用劑量。西藥喜得鎮(zhèn)由瑞士山德士藥廠與天津華津制藥廠合作生產(chǎn)[（91）衛(wèi)藥準(zhǔn)字X-156號，1 mg/片]，混懸液濃度為0.027 mg/ml，相當(dāng)于人常用劑量。硝普鈉，由北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號：0305072。
1.2 血管性認(rèn)知障礙動物模型的建立
VCI大鼠的造模方法：采用王蕊等[2]造模方法并加以改進：分將大鼠用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定在手術(shù)臺上，常規(guī)消毒，取頸正中切口，鈍性剝離結(jié)締組織和頸前肌群，分離雙側(cè)頸總動脈，腹腔注射硝普鈉2.5 ml/kg后，無創(chuàng)微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈10 min，再通10 min，再夾閉10 min，再通后，永久結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，并剪斷。傷口灑青霉素粉適量，縫合傷口。假手術(shù)組手術(shù)過程同模型組，但不阻斷雙側(cè)頸總動脈，不注射硝普鈉，在手術(shù)過程中，保持動物肛溫（37.0±0.5）℃。
1.3 分組與給藥
造模前按隨機數(shù)字表隨機抽取10只為假手術(shù)組。其余大鼠進行造模。在造模后存活（術(shù)中死亡20只）的40只大鼠隨機分為康欣膠囊復(fù)方中藥組（復(fù)方組）、康欣膠囊簡化方中藥組（簡方組）、西藥對照組、模型組，每組10只。造模后第2周予以每日胃灌注（4.5 ml/kg各種液體），假手術(shù)組和模型組用生理鹽水灌胃，復(fù)方組、簡方組和西藥對照組分別予康欣膠囊全方、康欣膠囊簡化方和喜得鎮(zhèn)混懸液，均每日給藥1次，連續(xù)灌藥3周。給藥兩周后開始Morris水迷宮實驗，共6 d，期間繼續(xù)給藥，次日處死動物。
1.4 行為學(xué)觀察
Morris水迷宮[3]：水迷宮的水池直徑100 cm，深50 cm，水深30 cm，水溫（26±2）℃，水面覆一層泡沫塑料屑，池壁上4個等距離點分水池為4個象限，池壁外標(biāo)4個入水點，任選一象限在其中央放置平臺。平臺無色透明，直徑6 cm，高28 cm，平臺沒于水面下2 cm，水池周圍參照物保持不變。Morris水迷宮主要包括定位航行實驗和空間探索實驗兩個部分。
定位航行實驗：檢測大鼠對平臺位置的學(xué)習(xí)和記憶的能力。連續(xù)訓(xùn)練5 d，每日上午、下午兩個時段，兩次間隔8 h以上。在每個時間段訓(xùn)練4次，分別從4個象限的入水點將大鼠放入水中。如果大鼠在60 s內(nèi)爬上平臺，并停留3 s以上，則認(rèn)為大鼠找到平臺，此為潛伏期。如果60 s內(nèi)大鼠未能找到平臺，則拖拽其尾部，將其引導(dǎo)到平臺，熟悉10 s，此時潛伏期按60 s計算。每次訓(xùn)練間隔為5 min。計算每一時段4個方向潛伏期的平均數(shù)，然后把每一日上午、下午兩個時段潛伏期的平均數(shù)作為該日的游泳結(jié)果。
空間探索實驗：測試大鼠學(xué)會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的能力。定位航行實驗后，即在第6天上午，撤去平臺，取任意一個入水點將大鼠放入水中，觀察并記錄60 s內(nèi)大鼠穿過原平臺區(qū)域的次數(shù)。
1.5 統(tǒng)計學(xué)方法
使用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 造模后血管性認(rèn)知障礙大鼠一般情況
蘇醒后大鼠活動能力下降，自發(fā)運動減少，少數(shù)大鼠自發(fā)運動增加。48 h內(nèi)所有存活大鼠都逐漸恢復(fù)正常飲食及大便。
2.2 各組大鼠Morris水迷宮試驗比較
與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少（P＜0.05）；復(fù)方組、簡方組、西藥對照組與模型組比較，逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺區(qū)域的次數(shù)明顯增多（P＜0.05）；復(fù)方組、簡方組、西藥對照組兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。
表1 各組大鼠逃避潛伏期及穿越平臺區(qū)域次數(shù)比較（x±s）
注：與模型組比較，P＜0.05，P＜0.05
3 討論
臨床和神經(jīng)心理學(xué)研究表明，按照癡呆的診斷標(biāo)準(zhǔn)不能發(fā)現(xiàn)許多血管因素導(dǎo)致的認(rèn)知障礙，尤其是未達(dá)到癡呆標(biāo)準(zhǔn)者，也就不能實現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)和早期預(yù)防。因此，一些學(xué)者提出應(yīng)該用更寬泛的VCI概念來代替血管性癡呆，目的是將血管性癡呆的診斷從傳統(tǒng)的癡呆標(biāo)準(zhǔn)中擺脫出來。VCI是一種可以預(yù)防的癡呆，早期治療具有可逆性[4]。因此，廣泛采用VCI診斷標(biāo)準(zhǔn)，對處于早期或癥狀前期的患者進行治療及Ⅱ級預(yù)防和Ⅰ級預(yù)防，意義深遠(yuǎn)。
中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病的發(fā)病與腎精不足、五臟虧虛、氣血不足有密切關(guān)系。康欣膠囊以補腎健脾、養(yǎng)血活血為立法，方中女貞子、黃精等補腎填精，羊藿溫腎壯陽，當(dāng)歸養(yǎng)血活血，佐以丹皮、山楂等藥。藥理研究表明，方中諸藥多具有清除氧自由基、抗衰老、增強免疫力、抗動脈粥樣硬化、減輕腦缺氧缺血后再灌注損傷等多種作用。既往的研究顯示，康欣膠囊有效增加海馬、下丘腦等部位乙酰膽堿（Ach）、多巴胺（DA）的合成；防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而保護神經(jīng)細(xì)胞，改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[5-6]。
Morris水迷宮實驗是檢測空間方向、反射時間、視知覺和結(jié)構(gòu)應(yīng)用等空間學(xué)習(xí)記憶能力。本實驗選用逃避潛伏期、通過平臺次數(shù)等指標(biāo)，來反映大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。大鼠空間記憶力越好，其逃避潛伏期越短，通過平臺次數(shù)也越多。本實驗研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠的各指標(biāo)均明顯優(yōu)于模型組，說明模型組大鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，造模成功。復(fù)方組、簡方組、西藥對照組與模型組比較，逃避潛伏期明顯縮短、穿越平臺區(qū)域的次數(shù)明顯增多，說明各用藥組均能明顯改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。
對于血管性認(rèn)知障礙這個新概念，目前中醫(yī)、西醫(yī)都處于探索研究階段。中醫(yī)藥在改善癥狀，延緩病程進展，減緩長期服用西藥的不良反應(yīng)，提高療效等方面有一定的優(yōu)勢，因此通過本次動物實驗觀察，以期能為中醫(yī)藥對VCI的深入研究有所裨益。
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【摘要】 目的 觀察異丙酚預(yù)處理對擬AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能和海馬損傷神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFT）和bcl2表達(dá)的影響，分析異丙酚的腦保護作用。方法 大鼠海馬CA1區(qū)微量注射岡田酸（Okadaic acid，OA），建立擬AD大鼠模型。異丙酚預(yù)處理組大鼠于擬AD模型制作前30 min，腹腔注射異丙酚100 mg/kg。然后用Morris水迷宮觀察大鼠行為學(xué)變化，Bielschowsky染色觀察NFT及免疫組化方法觀察bcl2表達(dá)的變化。結(jié)果 與對照組大鼠相比，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低；Bielschowsky染色觀察海馬CA1區(qū)域出現(xiàn)大量NFT的特征性病理變化，免疫組化bcl2表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。與模型組大鼠相比，異丙酚預(yù)處理組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高；海馬CA1區(qū)NFT明顯減少或消失，免疫組化bcl2表達(dá)明顯增多（P＜0.05）。結(jié)論 擬AD模型建立前30 min異丙酚預(yù)處理能改善擬AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，能降低NFT的表達(dá)，增高bcl2表達(dá)，有明顯的腦保護作用。
【關(guān)鍵詞】 阿爾茨海默病；異丙酚；岡田酸；學(xué)習(xí)記憶；神經(jīng)原纖維纏結(jié)；bcl2
【Abstract】 Objective To study the effects of propofol pretreatment on learning and memory ability，and to investigate the expression of neurofibrillary tangles(NFT) and bcl2 of hippocampus tissues in Alzheimer’s diseaselike model rats，and to analyze the protective effects of propofol on brain. Methods Okadaic acid (OA) was injected into hippocampal CA1 region of rats in model group and pretreatment group to establish Alzheimer’s diseaselike model. Rats in the pretreatment group were abdominally injected with propofol (100mg/kg) before making ADlike model. The learning and memory abilities of rats were assessed through Morris water maze behavioral test. NFT were the characteristic pathological changes of AD，examined by Bielschowsky stain of hippocampus，and the expressions of bcl2 were examined by immunohistochemistry in hippocampus CA1 region of the rats. Results Compared with control group rats， the abilities of learning and memory decreased. Many NFTs were observed in hippocampal CA1 region. The expression of bcl2 in the CA1 region decreased (P＜0.05). Compared with model rats，the abilities of learning and memory of propofol group rats improved. NFT was reduced in hippocampal CA1 region. The expressions of bcl2 in the CA1 region increased(P＜0.05).Conclusion Treated with propofol at 30 minutes before injecting OA can ameliorate the neurobehavioral score of rat with hippocampus injury，reduce the level of NFT and increase the expression of bcl2 in brain tissues of rats with OA injury，which has significant protective effects on brain.
【Key words】 Alzheimer’s disease，propofol，Okadaic acid，learning and memory， neurofibrillary tangles，bcl2
阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年人中發(fā)病率高、危害性大的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。到目前為止，其確切病因和發(fā)病機制尚不完全清楚，臨床上首先表現(xiàn)為近期記憶力減退，繼而表現(xiàn)為持續(xù)性智能衰退、失語、判斷推理能力喪失以及運動功能障礙。腦藥物預(yù)處理是通過藥物激發(fā)或模擬機體自身內(nèi)源性保護物質(zhì)而呈現(xiàn)的腦保護作用，藥物性預(yù)處理具有相對安全、方便、易于控制劑量等優(yōu)點。異丙酚（propofol）為目前最為常用的靜脈全麻藥物，因其苯環(huán)上的結(jié)構(gòu)與天然的抗氧化劑維生素E相似，因而具有了一定的清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用［1］，一些在體動物實驗證實了異丙酚具有腦保護效應(yīng)［2～5］。本實驗利用擬AD大鼠模型，觀察了用異丙酚預(yù)處理海馬組織中NFT及bcl2含量的變化，并結(jié)合學(xué)習(xí)記憶能力的改變，評價異丙酚的腦保護作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組 3～5個月齡健康雄性SD大鼠36只，體重200～250 g，均購自山東大學(xué)實驗動物中心。隨機分為3組：正常對照組（簡稱對照組）、擬AD模型組（簡稱模型組）、異丙酚預(yù)處理組(簡稱異丙酚組)，每組12只，自然條件下飼養(yǎng)，自由飲食，光線濕度適中。
1.2 實驗試劑和儀器 實驗試劑：Okadaic acid（OA）粉劑購自美國sigma公司，臨用前溶解于10%二甲亞砜（DMSO），配制成0.4 mmol/L溶液；抗bcl2抗體、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；靜安（異丙酚），北京尤費森尤斯卡比制藥有限公司分裝（批號UI 152，進口編號H20060427）。主要儀器：研究用生物顯微鏡（帶攝像裝置及圖像分析系統(tǒng)）為德國Leica公司產(chǎn)品；全自動Morris水迷宮，上海吉量軟件科技有限公司；腦立體定位儀DYTⅠ，中國天津生產(chǎn)。
1.3 實驗方法和步驟
1.3.1 擬AD模型制作：模型組、異丙酚組大鼠稱重，選擇右側(cè)海馬為注射靶區(qū)，10%水合氯醛腹腔麻醉（300 mg/kg）后，固定于腦立體定位儀上，顱頂皮膚常規(guī)消毒，剪去頭皮，充分顯露顱骨，參照George等［6］的《大鼠腦立體定位圖譜》，于前囟后（A）3.6 mm，中線右側(cè)（R）旁開2.4 mm處用直徑1 mm的顱骨鉆鉆一小孔，垂直插入自行設(shè)計的十字形管，牙科水泥固定。通過十字形管用微量注射器進行海馬CA1區(qū)微量注射（深度2.7 mm），模型組、銀杏內(nèi)酯組、聯(lián)合組大鼠均經(jīng)縱管緩慢注射0.4 mmol/L的OA 0.5 μl，5 min注射完畢，留針10 min。每隔2 d按同樣方法劑量注射1次，共5次。對照組用同樣方法注入等體積的對照液10% DMSO。術(shù)后大鼠肌注青霉素10萬單位預(yù)防感染，連續(xù)5d。
1.3.2 異丙酚腹腔注射：異丙酚預(yù)處理組大鼠于擬AD模型制作前30 min，腹腔注射異丙酚100 mg/kg，對照組、擬AD模型組用同樣方法腹腔注射生理鹽水。
1.3.3 大鼠行為學(xué)檢測：大鼠行Morris水迷宮定向航行實驗（place navigation test）和空間探索實驗（spatial probe test），Morris水迷宮由周圍水池和自動錄像、記錄系統(tǒng)兩部分組成。Morris水迷宮水池直徑160 cm，深50 cm，攝像鏡頭安放于水池中心上方2 m高度。將各象限水池壁中點標(biāo)為入水點，標(biāo)記4個象限。站臺直徑12 cm，高30 cm，固定于第3象限，水池中水面高出站臺平面1 cm。水中加入適量黑色素，以肉眼看不見站臺為宜，保持水溫（25±1）℃。周圍環(huán)境安靜，恒定光源。實驗開始前1 d將每只大鼠單獨放入未放站臺的水池中2 min，使其適應(yīng)水迷宮環(huán)境及學(xué)習(xí)游泳。實驗時將大鼠分別從4個象限的固定入水點放入水池，自動錄像系統(tǒng)記錄大鼠找到平臺的時間和游泳路徑。水迷宮實驗于海馬CA1區(qū)首次注射后的第4周開始進行，共7 d。第1～6天進行定向航行試驗：每日將大鼠按順序ⅣⅢⅡⅠ象限從各入水點靠池壁放入水中（鼠頭朝向池壁，鼠尾沒入水中），記錄60 s內(nèi)大鼠從入水到爬上站臺所需時間即逃避潛伏期（以在站臺上停留達(dá)到或超過10 s為上臺，不足10 s不作為上臺）。每只大鼠每天訓(xùn)練4次，上下午各2次，每只每次間隔時間15 min，中午間隔2 h。訓(xùn)練過程中，若大鼠60 s內(nèi)找到站臺，讓其在站臺上停留10 s，若未找到站臺，引導(dǎo)大鼠上站臺，并停留10 s，潛伏期記為60 s；第7天進行空間探索實驗：撤去站臺，將大鼠從第1象限入水點放入水池，記錄120 s內(nèi)大鼠在各象限的游泳時間和穿越站臺次數(shù)，作為評價大鼠學(xué)習(xí)成績的指標(biāo)。
1.3.4 灌注取材：水迷宮試驗結(jié)束后，將各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛（按體重450 mg/kg，腹腔注射）深麻后，快速灌入生理鹽水150 ml，然后改用10%中性緩沖甲醛（4℃）150 ml灌注，斷頭取腦，置10%中性緩沖甲醛中浸泡固定7 d。取海馬注射點前后約3 mm厚標(biāo)本，經(jīng)脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋后行大鼠海馬冠狀位切片，片厚4 μm。同時觀察每只大鼠標(biāo)本海馬注射軌跡，注射深度或位置未達(dá)要求者不納入統(tǒng)計處理。
1.3.5 Bielschowsky染色：切片脫蠟至水化，用2 %硝酸銀水溶液避光浸染于37℃水浴箱內(nèi)孵育30 min；10%福爾馬林液還原數(shù)秒鐘至切片呈現(xiàn)黃色為止；用氨銀溶液滴染20～40 s，傾去染液，直接用10%福爾馬林液再次還原1～2 min，使切片呈棕黃色；用0.2 %氯化金溶液調(diào)色2～5 min；5 %硫代硫酸鈉水溶液固定3～5 min；然后脫水、透明，中性塑膠封固。
1.3.6 免疫組織化學(xué)兩步法：切片常規(guī)脫蠟至水；滴加3%H2O2，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（TBS，pH 6.0）中，微波爐“高火”加熱至沸騰3 min，后改為“保溫”10 min。冷卻后磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2～7.6）洗滌2次；滴加適當(dāng)稀釋的一抗（兔IgG）， 37℃恒溫水浴箱孵育30 min，PBS洗滌2 min×2次；滴加通用型IgG抗體（Fab段）HRP多聚體，37℃恒溫水浴箱孵育20 min ，PBS洗滌2 min×2次；DAB溶液顯色：使用DAB顯色試劑盒，取1 ml蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片；室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，一般5～30 min；蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。
1.3.7 顯微鏡觀察 采用Leica攝像顯微鏡觀察并照像。NFT可在海馬CA1區(qū)形成并在軸突和胞體處染色較深并呈拖尾形狀，bcl2免疫組化陽性細(xì)胞在光鏡下可見胞質(zhì)、胞膜和突起呈棕黃色或棕色。計數(shù)每張切片4個隨機高倍視野中陽性細(xì)胞數(shù)后取平均值作為計數(shù)結(jié)果，每組10張切片計數(shù)結(jié)果取平均值作為最后結(jié)果。
1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件包，數(shù)據(jù)先進行單因素方差分析，多組之間差異兩兩比較采用SNK檢驗進行分析，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計結(jié)果以x±s表示。
2 結(jié)果
2.1 實驗動物數(shù)量分析 共有36只健康雄性SD大鼠接受實驗，順利接受麻醉、異丙酚預(yù)處理、擬AD模型建立、神經(jīng)行為學(xué)評分和海馬損傷NFT、bcl2測定的有33只。在接受海馬CA1區(qū)OA注射和異丙酚預(yù)處理時，有2只大鼠死亡、1只出現(xiàn)偏癱無法進行余下實驗，這可能與動物的個體差異不能耐受實驗有關(guān)。隨機取30只作為實驗樣本，每組10只。海馬注射深度或位置未達(dá)要求者不納入統(tǒng)計處理，故剔除不合標(biāo)準(zhǔn)的，在測定海馬組織損傷表達(dá)的時候，每組選取8只大鼠作為實驗樣本。
2.2 大鼠行為學(xué)檢測 各組大鼠在Morris水迷宮中定向航行實驗結(jié)果見表1。對照組及異丙酚預(yù)處理組的平均逃避潛伏期均漸縮短，從第1天開始，模型組與對照組比較，平均逃避潛伏期均明顯延長（P＜0.05）；異丙酚預(yù)處理組與模型組比較，平均逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05）。撤去站臺后，以在原站臺象限（第3象限）的活動時間和穿越站臺次數(shù)為指標(biāo)，模型組與對照組比較，第3象限活動時間明顯縮短（P＜0.05），穿越站臺次數(shù)明顯減少（P＜0.05）；異丙酚預(yù)處理組與模型組比較，第3象限活動時間明顯延長（P＜0.05），穿越站臺次數(shù)明顯增多（P＜0.05）（見表2）。在第7天撤去平臺之后，對照組、異丙酚預(yù)處理組大鼠以繞平臺游泳和穿梭游泳方式為主，有少量環(huán)池游泳；模型組以穿梭游泳和環(huán)池游泳為主，有少量繞平臺游泳。結(jié)果表明，與對照組相比較，模型組大鼠行為模式發(fā)生了改變，異丙酚預(yù)處理組的行為模式更接近于對照組。表1 各實驗組大鼠定向航行實驗中每日平均逃避潛伏期表2 各實驗組大鼠空間探索實驗第3象限活動注：*與對照組比較，P＜0.05；與模型組比較，P＜0.05
2.3 海馬CA1區(qū)NFT表達(dá) 對照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞未見明顯改變（圖1A）；擬AD模型組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層細(xì)胞神經(jīng)原纖維增粗、粗細(xì)不等、排列紊亂，有的密集成團塊狀，呈編織狀遍布細(xì)胞質(zhì)并深入到細(xì)胞突起，形成NFT（圖1B）。模型組與對照組比較，NFT明顯增多（P＜0.05）；異丙酚預(yù)處理組同模型組比較，NFT明顯減少（P＜0.05）（見表3，圖1C）。 表3 各實驗組大鼠海馬CA1區(qū)NFT神經(jīng)元計數(shù)
2.4 海馬CA1區(qū)bcl2的表達(dá) 正常對照組大鼠海馬CA1區(qū)bcl2陽性細(xì)胞表達(dá)較多，可見胞質(zhì)、胞膜和突起呈棕黃色或棕色（圖2A）；模型組大鼠海馬CA1區(qū)bcl2陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少（圖2B），與正常對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）；異丙酚預(yù)處理組表達(dá)增多，與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表4，圖2C）。 注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，P＜0.05
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眾所周知，海馬作為邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，是近期記憶回路的重要結(jié)構(gòu)，是學(xué)習(xí)記憶的重要解剖基礎(chǔ)和神經(jīng)中樞，在學(xué)習(xí)、記憶、情緒反應(yīng)及植物神經(jīng)功能等方面發(fā)揮著重要作用［7］，更因其結(jié)構(gòu)上具有高度的序化板層構(gòu)筑和神經(jīng)元相對獨立分布等特點而成為最理想的學(xué)習(xí)記憶的研究模型［8］。許多研究表明，海馬與機體衰老、阿爾茨海默病及癲癇發(fā)作有著非常密切的關(guān)系。由于海馬不同區(qū)域的功能不盡相同，其中CA1和CA3區(qū)在學(xué)習(xí)、記憶中擔(dān)負(fù)重要作用［9］。海馬CA1區(qū)發(fā)育最晚，但是最早出現(xiàn)老化的部分。故本實驗將注射部位定位于海馬CA1區(qū)。我們評價學(xué)習(xí)記憶的設(shè)備是帶攝像裝置及分析軟件的Morris水迷宮，實驗數(shù)據(jù)不受人為因素的影響，結(jié)果更為客觀、真實。本實驗發(fā)現(xiàn)模型組大鼠在注射OA結(jié)束后的水迷宮行為學(xué)實驗從第1天起就出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降。模型組海馬CA1區(qū)GFAP免疫陽性神經(jīng)元顯著增多，銀染結(jié)果顯示模型組海馬CA1區(qū)出現(xiàn)較多的NFT，這與AD的主要病理變化相吻合。
我們通過改進的Bielschowsky染色發(fā)現(xiàn)，OA可導(dǎo)致大鼠海馬和皮層神經(jīng)元內(nèi)產(chǎn)生大量的NFT。異丙酚預(yù)處理組海馬內(nèi)NFT數(shù)量減少，與擬AD模型組比較差異顯著（P＜0.05）。NFT是導(dǎo)致神經(jīng)元纖維退化的主要原因［10］，目前認(rèn)為NFT的形成與AD病人的認(rèn)知功能障礙呈明顯的正相關(guān)。NFT主要成分是過度磷酸化的tau蛋白和少量微管蛋白。正常tau蛋白是可溶性的，可將營養(yǎng)物質(zhì)從胞體輸送到突觸末端，而過度磷酸化的tau蛋白則是不溶解的，扭曲變形的微管蛋白不能正常輸送營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致神經(jīng)元末端的樹突和軸突發(fā)生營養(yǎng)不良性萎縮。我們推測異丙酚可能影響tau蛋白的異常磷酸化，減少NFT的形成，從而保證軸漿的正常運輸。異丙酚組海馬CA1區(qū)bcl2陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量明顯增加，表明bcl2在擬AD大鼠學(xué)習(xí)記憶改善過程中發(fā)揮作用。目前研究認(rèn)為bcl2基因及其蛋白bcl2可以抑制或阻斷多種因素引起的細(xì)胞凋亡，并認(rèn)為bcl2抑制細(xì)胞凋亡的機制與bcl2能抑制Caspase的基因表達(dá) ［11］，并具有穩(wěn)定線粒體外膜，調(diào)節(jié)線粒體功能，阻止細(xì)胞色素C的釋放［12］，降低鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的釋放［13］，以及抑制自由基產(chǎn)生，抗氧化等作用有關(guān)。
近年來，靜脈麻醉維持和誘導(dǎo)藥物異丙酚的腦保護效應(yīng)尤為引人注目，大量動物實驗和人體試驗都發(fā)現(xiàn)異丙酚具有腦保護效應(yīng)，它有良好的對抗應(yīng)激性血糖升高作用，同時能保證腦氧供需平衡，通過阻滯或減輕繼發(fā)性腦損害，改善腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)功能而產(chǎn)生腦保護作用。其腦保護機制可能是：①鈣通道阻滯藥作用：研究表明，異丙酚可其直接或間接地抑制Ca2+經(jīng)NMDA受體耦聯(lián)Ca2+通道和電壓依賴性Ca2+通道進入胞內(nèi)，減少自由基的產(chǎn)生［14］，通過解除缺血區(qū)腦微循環(huán)灌注，減少線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子活化產(chǎn)生的細(xì)胞損傷。②自由基清除劑作用：異丙酚的活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和已知的氧自由基清除劑丁羥基甲苯和維生素E一樣具有酚羥基結(jié)構(gòu)［1］，可有效地防止甲基（酰）門冬氨酸積聚，與氧自由基反應(yīng)生成酚基氧自由基，從而抵抗氧自由基的作用。③激活γ氨基丁酸A受體：異丙酚可以增強氟硝基安定與中樞苯二氮艸卓類受體的結(jié)合，從而增加開啟Cl通道的頻率，增強γ氨基丁酸的效應(yīng)；還可以下調(diào)NMDA受體拮抗劑所誘導(dǎo)的cfos基因和HSP70基因在后扣帶皮質(zhì)回的表達(dá)，從而阻斷NMDA受體拮抗劑所致的神經(jīng)毒性，減輕后扣帶皮質(zhì)回神經(jīng)元的組織病理損害［15］。
本實驗結(jié)果，異丙酚預(yù)處理的擬AD模型大鼠，空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善，海馬CA1區(qū)少見或未見NFT，bcl2表達(dá)增高。表明擬AD模型建立前30 min異丙酚預(yù)處理能改善擬AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，降低NFT的表達(dá)，增高bcl2表達(dá)，有明顯的腦保護作用。
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關(guān)鍵詞：文化；人類學(xué)；危機；生命文化學(xué)
眾所周知，人類學(xué)家宣稱，人類學(xué)是關(guān)于人類歷史的科學(xué)。美國的人類學(xué)研究傳統(tǒng)分為四支（特別是在Boasians的研究推動之后）：生物人類學(xué)、考古人類學(xué)、語言人類學(xué)和文化人類學(xué)[1]。Robert Borofski（2002）的研究揭示出來，在文化人類學(xué)的子分支之間的聯(lián)系已經(jīng)非常薄弱[2]。人類學(xué)的分支越來越專一化。過度的專業(yè)化是人類學(xué)面臨的一個問題。
人類學(xué)面臨的第二個問題是“文化”這個詞本身。20世紀(jì)初，人類學(xué)家把人類學(xué)界定為關(guān)于文化的科學(xué)，而現(xiàn)在人類學(xué)家逐漸變?yōu)槲幕芯糠矫娴膶＜襕3]。人類學(xué)家把文化界定為他們用來研究世界上不同人類群體的生活方式的理論、認(rèn)識論和方法論的工具。大量關(guān)于文化的概念起源于20世紀(jì)的上半個世紀(jì)[4]。盡管文化的概念眾多并且沒有確立一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，但是人類學(xué)家普遍承認(rèn)這樣的假設(shè)：文化是后天習(xí)得的，基于符號的歷史產(chǎn)物。換句話說，文化與自然相對，擁有自己存在和進化的方式。
而到了20世紀(jì)下半葉，文化達(dá)到了一種濫用的程度，尤其是被“種族中心論”的人誤用。Adam Kuper陳述了它的成功：“現(xiàn)在每個人都進入到文化中來。”[5]換句話說，我們正在見證這個世界的文化膨脹。
Keesing在1974年預(yù)測了未來的研究熱點：“‘雅諾馬米文化’、‘日語文化’、‘文化的發(fā)展’、‘自然與文化’：我們的人類學(xué)家仍然使用這個詞，我們?nèi)匀徽J(rèn)為這意味著什么。但是從靈長類動物存在的學(xué)習(xí)傳統(tǒng)，使用工具和操縱符號，我們再也不那么肯定文化符號的習(xí)得性遺傳是人類所獨有的了。”
僅僅一年后，Edward Wilson出版了《社會生物學(xué)：新的綜合》。他定義社會生物學(xué)為“所有社會行為生物學(xué)基礎(chǔ)的系統(tǒng)研究。[6]”同時，他宣稱社會生物學(xué)的目的是“利用當(dāng)代綜合進化論的成果重新規(guī)劃社會科學(xué)。[7]”
自從70年代以來，所謂的進化派社會科學(xué)一直在學(xué)術(shù)界中發(fā)展和傳播。我用“進化的社會科學(xué)”這一標(biāo)簽來稱謂用進化論的方法來研究人類文化的那一派研究。這個標(biāo)簽反映了在科學(xué)和社會科學(xué)研究前沿的交叉，現(xiàn)在有很多學(xué)者使用這個詞。在進化的社會科學(xué)領(lǐng)域最先進的無疑是社會生物學(xué)、進化心理學(xué)、人類行為生態(tài)學(xué)，人類行為學(xué)，模因論、以及“基因――文化”共同進化的的方法。上述學(xué)科的代表發(fā)展了他們自己關(guān)于文化的概念，我們稱之為文化進化論。
那么，早期文化人類學(xué)家把文化定義為一種后天習(xí)得的基于符號的歷史產(chǎn)物，而社會生物學(xué)家的定義則是完全對立的，他們認(rèn)為文化是一種生物學(xué)上的適應(yīng)性，或者說文化是符合“自私的基因”的利益的。進化心理學(xué)和人類行為學(xué)中也有關(guān)于文化的類似表達(dá)。
人類行為生態(tài)學(xué)和“基因――文化”共同進化理論，都在文化人類學(xué)對立的角度使用文化的概念，但是在研究方法上兩者有所不同。他們認(rèn)為文化不是生物適應(yīng)的產(chǎn)物，基因并不能操縱文化。
在行為生態(tài)學(xué)中文化是在某種特定的生態(tài)環(huán)境下生物最大化自己繁殖度的適應(yīng)性策略。他們在人類行為的水平上研究文化；他們認(rèn)為文化是一種對于當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境和社會文化環(huán)境的適應(yīng)型策略（SmithWinterhalder1992）.那么，文化是一種行為的適應(yīng)性。
共同進化方法包括基因和文化之間的相互動力系統(tǒng)。例如，William Durham已經(jīng)列出了基因與文化作用的五種關(guān)系（1991）：cultural mediation（文化調(diào)節(jié)），genetic mediation（基因調(diào)節(jié)），enhancement（增強），neutrality（中立）and opposition（反對）.前三種是互動的，后兩種是比較的（Durham 1991，205207）。總之，他認(rèn)為兩者在互動中可能會影響到對方。基因與文化的關(guān)系將參照：（1）相同的目標(biāo)（增強）；（2）矛盾的目標(biāo)（反對）；（3）不同，但目標(biāo)并不矛盾（中立）。文化不能解釋為基因進化的產(chǎn)物。在協(xié)同進化理論中，文化是基因與社會文化環(huán)境協(xié)同進化的產(chǎn)物。
在前面的論述中，我概述了目前的被看作是整體科學(xué)的人類學(xué)中的危機。首先是，人類學(xué)的過度強調(diào)分支化和跨人類學(xué)的薄弱的合作性。其次，危機的根源是，文化概念在人類學(xué)中的滑坡，它被指責(zé)將西方的工具加在非西方的社會中的一種中心主義的建構(gòu)。第三個根源是，“文化”這個概念的膨脹，人類學(xué)成功地給出“模因”，并認(rèn)為它承載了一個更為寬泛的意義，它最終將涵括任何東西。并且如果是在這種意義上，文化實際上是一個空洞的詞匯。危機的最后一個根源是，在進化社會科學(xué)中對文化這個概念的寬泛的討論。它的表征是從人類學(xué)意義上來使用這個概念，但是一般來說，這并不是一個合適的背景。
基于文化學(xué)理論框架的生命文化學(xué)，方便了人們對進化社會科學(xué)和人類學(xué)的理解，生命文化學(xué)是一個文化學(xué)的分支。生命文化學(xué)這個概念是由美國人類學(xué)家伊諾?若斯在1980年提出的，它是一個物理人類的分支的標(biāo)簽，主要是從文化人類學(xué)的觀點，來關(guān)注文化和生物現(xiàn)象。生命文化進化從文化屬于非生物學(xué)的適應(yīng)性這個前提出發(fā)，將人類與其它生物區(qū)分開來，但是它并不意味著，人類獨立于他過去的進化。
相反，文化有它進化的根源，人類是被他的特征所決定的，并且建立在人類基因的生物進化過程中。另外，生命文化學(xué)處理一種更為寬泛的主題包括動物和人類的不同。生命文化學(xué)進一步研究的是生物和文化適應(yīng)性及進化之間的關(guān)系，分析社會生活的主要因素，并關(guān)注后天PK先天討論的結(jié)論。生命文化學(xué)可以從文化人類學(xué)的傳統(tǒng)這一方面和從進化社會學(xué)另一方面，為了支持人類作為生命文化個體的整合性研究。簡單來講，生命文化學(xué)采用了從科學(xué)和社會科學(xué)中認(rèn)識的相關(guān)的發(fā)現(xiàn)并從文化角度來進行解釋。
生命文化學(xué)對于目前的人類學(xué)在三個方面的難題起作用。首先，生命文化學(xué)支持科學(xué)和社會科學(xué)的交叉性學(xué)科的合作性研究。其次，它將文化看作是在科學(xué)對人的研究中理論上、認(rèn)識論上和方法論上的工具。最后，它方便了對人類學(xué)和進化論方法在文化的研究上，對人類本質(zhì)的二分的難題的克服。
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