時間：2023-05-30 10:45:55
開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇巨噬細胞，希望這些內容能成為您創作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進步。
巨噬細胞活化綜合征(macrophage activation syndrome,MAS)是兒童慢性風濕性疾病的嚴重并發癥,臨床主要表現為持續發熱,淋巴結及肝脾腫大,全血細胞減少,嚴重肝功能損害,凝血障礙及神經系統受累等多臟器病變,骨髓細胞學顯示有分化良好的巨噬細胞吞噬血細胞現象[1]。1985年Hadchouel等[2]。第一次報道了soJIA患兒病程中出現類似MAS的臨床表現,提示可能與大量異常活化的非腫瘤性巨噬細胞所致的噬血細胞現象相關。1993年Stephan等[3]首次提出了MAS的概念,他們發現這些患者存在單核巨噬細胞活化,臨床表現與噬血性淋巴組織細胞增生癥(HLH)相似。隨后MAS這個概念逐漸被風濕病學界認識和接受,關于MAS的報道也逐漸增多,近年來其他風濕性疾病如系統性紅斑狼瘡、皮肌炎、川崎病、滲出性多形性紅斑等[4]也有合并MAS的報道。現就巨噬細胞活化綜合征近年來的研究進展做一綜述。
1 MAS的流行病學特點
MAS是風濕性疾病少見的并發癥,目前尚無確切的關于MAS發病率的統計數據。隨著MAS研究的不斷深入,MAS的報道越來越多。胡堅等[5,6]對幼年特發性關節炎(juvenileidiopathic arthritis,JIA)并發MAS的個案報道是國內最早的文獻資料,隨后人們開始關注到MAS在幼年特發性關節炎全身型(soJIA)中并不少見[7-9]。Sawhne等[10]。報道103例全身型JIA患者中有7例合并MAS。Emmennegger等[11]。對反應性HLH患者進行同顧性研究發現約1/3的HLH患者滿足JIA的診斷標準。目前認為MAS男女發病率沒有明顯差異,沒有種族易感性,任何年齡均可發病,以兒童發病多見,并且大部分MAS患者存在有基礎病。
2 MAS的誘發因素
MAS發病確切的誘因尚不明確,可能與原發病活動、藥物作用、感染等有關。任何感染均可誘發MAS,包括病毒、細菌、真菌及寄生蟲等感染。EB病毒是誘發MAS最常見的感染因素,單純皰疹病毒和巨細胞病毒等也被認為是引起MAS常見的誘因。近10年的文獻資料顯示在治療soJIA過程中某些藥物可能引發MAS,這些藥物包括NSAIID類藥物(阿司匹林、布洛芬等)、病情改善藥物(金制劑、甲氨蝶呤等)、免疫抑制劑(如環磷酰胺)[13]和生物制劑(如TNF拮抗劑依那西普)[14、15]等。
3 MAS的發病機制
MAS確切發病機制目前尚不完全清楚,大部分關于MAS發病機制的假說都源于HLH。近年來研究發現,MAS的發病機制可能與穿孔素(perforin)基因異常表達和自然殺傷細胞(NK細胞)功能紊亂引發機體內細胞因子所致的瀑布反應有關[10-16]。穿孔素基因突變導致穿孔素蛋白表達減少[17],穿孔素蛋白是淋巴細胞、巨噬細胞和骨髓的前體細胞表達的一種蛋白質,它的主要作用是在細胞溶解過程中在細胞膜上形成小孔,引起靶細胞溶解。新近的研究也顯示多次發生MAS的soJIA患者,大部分穿孔素蛋白表達降低。曾華松等口朝對7例So-JIA并發MAS患者的研究發現,穿孔素A91V基因均為野生型,未發現有突變基因,未發現廣東地區漢族So-JIA并MAS患兒與穿孔素A91V基因多態性有關,考慮可能與個體特異體質有關。NK細胞在感染早期具有清除感染原作用,soJIA患者合并MAS中,NK細胞的數量和功能均降低。姚翠嬋等[20]報道10例soJIA病情反復難治者,發現9例患兒外周血NK細胞CDl6+56+比率降低,這些患兒并發MAS機會明顯增加,這也是soJIA患者容易并發MAS的原因[21]。當NK細胞功能下降,機體清除外來感染原能力降低,引起抗原驅動下T淋巴細胞持久激活和巨噬細胞活化因子大量產生,導致巨噬細胞過度活化釋放大量炎癥細胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α及干擾素α),即細胞因子瀑布,從而引起強烈自身免疫損傷[22],出現各種臨床癥狀及實驗室改變。對soJIA患兒檢測其NK細胞功能及穿孔素蛋白表達水平,也許有助于預測MAS的發生。
4 組織病理學特征
MAS的組織病理學主要表現為T淋巴細胞及活化的巨噬細胞浸潤。在骨髓及淋巴結中出現巨噬細胞噬血現象,浸潤也可出現在其他組織和臟器。1988年,Reiner等[23]對MAS患者的尸解研究發現巨噬細胞浸潤可出現在心臟、肝臟、胰腺、腎上腺及腦膜等。Billiau等[24]。報道了5例MAS患兒肝活檢病理結果顯示活化的CD8、T細胞和噬血細胞增生都參與了發病。
5 臨床特征與實驗室改變
5.1各系統臨床表現MAS主要并發于soJIA,多數發生于疾病活動期,少數也可發生在疾病的靜止期,個別病例甚至作為soJIA的首發癥狀[25]。MAS的起病非常急驟,進展迅速,其臨床主要表現為多臟器受累癥狀,甚至出現多臟器功能障礙或衰竭。重癥者預后差,病死率高。
發熱常常是MAS的首發癥狀,主要表現為高熱持續不退,多為稽留熱,有時為弛張熱。
肝臟受累在MAS中非常常見,表現為肝功能急劇減退甚至衰竭,出現惡心、嘔吐、黃疸、出血傾向及肝酶短期內迅速升高,伴有肝脾進行性增大。
MAS最具有鑒別診斷意義的臨床表現是中樞神經系統受累和出血順向[26]。中樞神經系統受累表現為一系列中樞神經功能障礙,包括嗜睡、煩躁、定向力障礙、頭痛、抽搐甚至昏迷等,部分患者出現頸項強直、肌張力異常(增高或降低),顱神經麻痹、失明、共濟失調及偏癱也不少見。出血傾向以皮膚黏膜出血為主要表現,類似于DIC,是MAS患者中最突出的異常表現,主要是凝血功能障礙所致,輕者表現為皮膚黏膜瘀點及瘀斑,較重的可有暴發性紫癜,鼻衄、消化道出血,甚至出現彌漫性血管內凝血(DIC)。
其他系統受累現象相對較少見。呼吸系統受累可出現呼吸衰竭,甚至急性呼吸窘迫綜合征。腎臟受累表現為血尿,蛋白尿,少尿及無尿,部分患兒可以出現。腎功能衰竭。心臟受累表現包括心包炎、心肌炎,心力衰竭及心律失常等。以上器官受累一經發生往往提示多臟器功能受累,預后不良,曾華松等[19]報道提示MOt-的發生是MAS預后差的指征。
5.2 實驗室改變MAS患者血象改變主要表現為白細胞、紅細胞和血小板一系或者一系以上降低。肝酶升高如ALT、AST、LDH及GGT增高。膽紅素輕度升高,以直接膽紅素升高為主。血脂包括甘油三酯可以增高,低白蛋白血癥,血氨水平多正常或輕度增高,血鈉下降等。凝血功能異常可有PT及APTT延長,纖維蛋白原降低,FDP增高,D-二聚體升高,V因子輕度下降,維生素K依賴凝血因子缺乏等。血沉(ESR)降低是MAS特征性實驗室改變。血清鐵蛋白的明顯升高也是MAS特征性改變之一。骨髓細胞學表現為反應性組織細胞增生,無惡性細胞浸潤,極期可見吞噬紅細胞、白細胞和血小板的吞噬性組織細胞。骨髓、淋巴結及肝臟活檢可見分化良好的極度增生活躍吞噬了血細胞的吞噬細胞[24]。
6 診斷標準與鑒別診斷
6.1 診斷標準MAS目前尚無統一的診斷標準。2005年,Ravelli等[26]根據流行病學研究資料,提出了全身型JIA合并MAS的診斷指南,見表1。
表1SOJIA合并MAS的參考診斷指標(2005年)
臨床標準
(1)CNS功能障礙(易激惹、定向力障礙、嗜睡、頭痛、抽搐、昏迷)
(2)出血表現(紫癜、易出血、黏膜出血)
(3)肝睥增大(肋緣下≥3 cm)
實驗室標準
(1)血小板≤262×109/L
(2)谷草轉氨酶>59 U/L
(3)白細胞≤4.O×109/L
(4)纖維蛋白原降低(≤2.5 g/L)
組織學標準
骨髓有巨噬細胞吞噬血細胞的證據
診斷原則:診斷MAS需要任何2個或以上的實驗室標準,3個或以上的臨床和(或)實驗室標準。骨髓中發現吞噬血細胞,僅僅是對于可疑病例才必須具備。
建議:上述診斷指標僅用于活動性s0JRA合并MAS,實驗室檢查值僅作為參考。
6.2 鑒別診斷診斷MAS必須排除其他疾病,如感染性疾病(如敗血癥、EB病毒感染),惡性疾病(如白血病、淋巴瘤及惡性組織細胞病),瑞氏綜合癥,以及藥物副作用等。近年來人們認識到MAS與HLH的關系非常密切,臨床上難以鑒別。HLH是組織細胞增生癥的一種類型,是以表型良性分化的單核細胞聚集為特征的疾病譜。HLH分為兩類,一類為原發性(家族性),是常染色體隱性遺傳病,多散發;另一類為繼發性(反應性),又分為感染相關性和腫瘤相關性HLH,多在兒童期發病,往往有明確誘發因素,比如EB病毒或巨細胞病毒感染。MAS的臨床表現及組織病理特點與HLH非常相似,但有其特殊性。2004年,國際組織細胞協會將。MAS做為獨立疾病單獨列出,分類在繼發性HLH中,特別強調與其他HIJH在治療方案上的不同。2005年,美國血液病協會也將其單獨描述,提出MAS與HLH的密切關系,強調HLH的診斷標準和治療方案不一定符合MAS,提示了MAS的特殊性。雖然HLH及MAS兩者的關系尚不清楚,在學術界上尚有爭議,但隨著對該病認識的不斷深入,越來越多的學者認為MAS是屬于組織細胞疾病范疇的風濕病相關性HLH[25-28]。
7 治 療
MAS是全身型JIA一種嚴重并發癥,有很高的病死率,做到早期診斷、早期治療至關重要,可以極大的改善預后,已往報道病例多數在短期內臨床治愈。目前常用的治療方法包括一般治療及特殊藥物治療。
7.1 一般治療針對MAS發病的不同誘因,存在感染時進行抗感染治療,及時停用可疑藥物,針對患兒臟器功能狀態做相應的呼吸循環支持等治療。
7.2 藥物治療主要包括腎上腺皮質激素及環孢素A。輕癥患兒口服潑尼松1～2mg/(Kg.d),癥狀體征及實驗室指標好轉后緩慢減量。重癥患兒常常需要大劑量甲潑尼松龍沖擊療法,劑量為15～30mg/(Kg.d),最大劑量為lg/d,連續使用3～5天,之后改為口服維持,可降低巨噬細胞活化復發。環孢素A對一些巨噬細胞活化的疾病如HLH有明顯效果[32,33],但其明確的免疫學機制并不十分確切。常用劑量為2～8mg/Kg.d,急性期應靜脈用藥,病情控制后改為口服治療。此外,使用環孢菌素A還能避免腎上腺皮質激素的過度使用。用藥期間應定期監測血藥濃度及腎功能,據此調整治療劑量。細胞因子拮抗劑如TNF受體拮抗劑依那西普(Etancerept)和LT拮抗劑阿那白滯素(Anakinra)也有一定療效,但易致感染發生,用藥前應明確有無感染存在。靜脈輸注丙種球蛋白(IVIG)、免疫抑制劑(如環磷酰胺等)、化療藥物(如VPl6)以及血漿置換治療因療效不確切,目前使用較少。新近開展的自體干細胞移植可能為MAS的治療帶來新的希望。
8 展 望
MAS是全身型JIA一種嚴重并發癥,在臨床上并不少見,早期診斷和早期治療對其預后至關重要。雖然廣大兒科醫師已逐漸認識到MAS的重要性,但目前國內外尚沒有關于soJIA合并MAS發病率的確切資料,對其發病機制也尚不清楚。因此,有必要開展前瞻性的多中心、大樣本流行病學調查,以了解soJIA合并MAS的發病率;相信隨著分子生物學和免疫學等現代醫學的飛速發展,人們對MAS病因和發病機制的認識會不斷清晰,對制訂MAS的診斷標準將會更加科學合理;干細胞技術的出現和發展,將給MAS根治帶來無限的希望。
【參考文獻】
[1] Ravelli A.Macrophage activation syndrome[J].Curr Opin Rheumatol,2002,14(5):548-552.
[2] HadchouelM,Prieur AM,Griscelli C.Acute hemorrhagic,hepatic and neurologic manifestations in juvenile rheumatoid arthritis:possible relationship to drug orinfection[J].J Pediatr,1985,106(4):561-566.
[3] StephanJ,Zeller J,Hubert P,et a1.Macrophage activation syndrome and rheumatic diseases in chiIdhood:a report of four new cases[J].CIin Exp Rheumatol,1993,11(4):451-456.
[4] 陳香元,曾華松.滲出性多形性紅斑并發巨噬細胞活化綜合征一例報告[J].中華臨床免疫和變態反應雜志,2008,2(3):234-235.
[5] 胡堅,黃文玉,張永梅,等.幼年類風濕性關節炎合并巨噬細胞活化綜合征2例報告[J].中國實用兒科雜志,2001,16(4):247-248.
[6] 仇佳晶,魏珉.幼年特發性關節炎全身型并發巨噬細胞活化綜合征一例[J].中華兒科雜志,2005,43(111):874-875.
[7] 李彩鳳,何曉琥,鄺偉英,等.幼年特發性關節炎全身型并發巨噬細胞活化綜合征24例臨床分析[J].中華兒科雜志,2006,44(11):806-811.
[8] 施紅,王宏偉,程佩萱,等.幼年特發性關節炎全身型并發巨噬細胞活化綜合征13例臨床分析[J].中華兒科雜志,2006,44(11):818-823.
[9] 胡堅,李崇巍,馬繼軍,等.兒童風濕性疾病合并巨噬細胞活化綜合征6例臨床分析[J].中華兒科雜志,2006,44(11):818-823.
[10] Sawhney S,Woo P,Murray KJ.Macrophage activation syndrome:a potentially fatal complication of rheumatic disorders[J].Arch DiS Chiid,2001,85(5):421-426.
[11] Emmennegger U,Reimers A,Frey U,et a1.Reactive macrophage activation syndrome:a simple screening strategy and its potential in early treatment initiation[J].Swiss Med Wkly,2002,132(4):230-236.
[12] Skripak JM,Rodgers GL,Martucci C,et a1.Disseminated herpes simplex(HSV) infection precipitating macrophage activation syndrome(MAS)in a child with systemic onset juvenile idiopathic arthritis(soJIA)undergoing therapy with infliximab [J].Pediatr Rheumatol Onl ine J,2003,3:58.
[13] 趙瑜,曹蘭芳.幼年特發性關節炎并發巨噬細胞活化綜合征1例報告[J].中國當代兒科雜志,2007,9(6):610.
[14] RamananAV,GromAA.Does systemic―onset juvenile idiopathic arthritis belong under juvenile idiopathic arthritis[J].Rheumatology(Oxford),2005,44(11):1350-1353.
[15] LuratiA,TeruzziB,SalmasoA,et a1.Macrophage activation syndrome(MAS)During anti―ILl receptor therapy(anakinra)in a patient affected by systemic onset juvenile idiopathic arthritis(soJIA).Pediatr Rheumatol Online J,2005,3(2):79-85.
[16] Grom AA.Macrophage activation syndrome and reactive hemophagocytic lymphohistiocytosis:the same entities[J].Curt Opin Rheumatol,2003,15(5):587-590.
[17] Goransdotter Ericson K,Fadeel B,Nilsson―A rdnor S,et a1.Spectrum of perforin
gene mutations in familial hemophagocytic lymphohistioeytosis[J].Am J Hum Genet,2001,68(3):590-597.
[18] Grom AA,Villanueva J,Lee S,et a1.NK cell dysfunction in patients with systemic
onset juvenile rheumatoid arthritiS and macrophage activation syndrome[J].J Pediatr,2003,142(2):292-296.
[19] 曾華松,陳香元,熊小燕,等.So-JIA并巨噬細胞活化綜合征臨床特征及穿孔素A91V基因分析[J].臨床兒科雜志,2009,27(7):601-607.
[20] 姚翠嬋,曾華松,韋茹,等.幼年特發性關節炎患兒外周血自然殺傷細胞cDl6+56+的隨訪意義[J].實用醫學雜志,2009,25(11):1764-1766.
[21] Villanueva J,Lee S,Giannini EH,et al.Natural killet cell dysfunction is a distinguishing feature of systemic onset juvenile rheumatoid arthritiS and macrophage activation syndrome[J].Arthritis Res Ther,2005,7(1):30-37.
[22] GromAA.Pathogenic mechanism in macrophage activation syndrome[J].Pediatr
Rheumatol Onl ine[J],2005,3(3):184-194.
[23] Reiner AP,Spivak JL.Hematophagie histioncytosis:A report of 23 new patients
and a review of the l iterature[J].Medicine,1988,67(6):369-388.
[24] Bukkuay AD,Roskams T,Van Damme―Lombaerts R,et al.Macrophage activation syndrome characteristic findings on liver biopsy illustrating the key role of activated,IFN-γ produc ing lymphocytes and IL一6 and TNF―a produc ing macrophages[J].Blood,2005,105(4):1648-1651.
[25] Cuende E,Vesga JC,Perez LB,et al.Macrophage activation syndrome as the initial manifestation of systemic onset juvenile idiopathic arthritis[J].CIin Exp Rheumatol,2001,19(6):764-765.
[26] Ravelli A,Magni―Manzoni S,Pistorio A,et a1.Preliminary diagnosticguidelines for macrophage activation syndrome complicating systemic juvenileidiopathic arthritis[J].J Pediatr,2005,146(5):598-604.
[27] RamananAV,Rosenblum ND,Feldman BM,et a1.Favorable outcome in Patients with renal involvement complicating macrophage activation syndrome in systemic onset juvenile rheumatoid arthritis[J].JRheumatol,2004,31(10):2068-2070.
[28] Grom.Natural killer cell dysfunction:A common pathway in systemic onset juvenile rheumatoid arthritiS,macrophage activation syndrome,and hemophagocytic 1ymphohisnocytosis[J].Arthrit Rheum,2004,50(3):689-698.
[29] Hemophagocytic lymphohistocytosis study group.Treatment protocol of the second internat ional HLH study.HLH,2004:11-27.
[30] Oritta J,Udozur S.Familial and acquired hemophagocytic lymphohistiocytosis.American Society of Hematology,2005:82-88.
[31] Tristanol AG.Macrophage activation syndrome:a frequent but under-diagnosed
complication associated with rheumatic diseases[J].Med SciMonit,2008,14(3):27-36.
【摘要】
目的： 檢測小鼠腹腔巨噬細胞TLRs表達情況及糖皮質激素甲基強的松龍對TLRs mRNA表達的影響. 方法： 應用RTPCR檢測正常小鼠腹腔巨噬細胞TLR113的表達；并以甲基強地松龍為免疫抑制劑，誘導小鼠免疫抑制后檢測腹腔巨噬細胞TLRs mRNA表達變化. 結果： 已發現的TLR113在正常小鼠腹腔巨噬細胞均有表達；小鼠腹腔巨噬細胞經糖皮質激素處理后，部分TLRs在mRNA水平上可被上調. 結論： Toll樣受體是抗真菌先天免疫的重要組成部分. 甲基強的松龍對巨噬細胞有毒性作用，甲基強的松龍注射后可導致小鼠腹腔巨噬細胞明顯減少.
【關鍵詞】 小鼠；潑尼松龍；免疫抑制法；Toll樣受體
【Abstract】 AIM: To test the expression of tolllike receptor 113 (TLR113) mRNA in the peritoneal macrophages of normal mice and the change of TLRs mRNA expression in peritoneal macrophages of immunosuppressed mice. METHODS: The expression of TLR113 mRNA in the peritoneal macrophages of normal mice was determined by RTPCR technique. Immunosuppressed mice were induced by intraperitoneal injections of prednisolone. The expression of TLRs mRNA in the peritoneal macrophages of immunosuppressed mice was tested with RTPCR. RESULTS: All thirteen of the TLRs reported to date were present in the macrophages of normal mice. Some of TLRs were upregulated in mRNA level when the mice were treated with glucocorticoids. CONCLUSION: TLRs are important component parts of innate immunity to fungal infections. Prednisolone has a toxic effect to macrophages and decreases the peritoneal macrophages of the mice.
【Keywords】 mice; prednisolone; immunosuppression; tolllike receptor
0引言
Toll受體在果蠅的發育和抗真菌免疫中具有顯著作用. 實驗證實TLRs(tolllike receptors)表達異常會使免疫炎癥反應不能正常發生，降低機體對病原微生物的清除能力［1］. 糖皮質激素(glucocorticoids， GC)可有效控制炎癥和抑制免疫反應［2］. 近20年來，由于應用糖皮質激素而致機體免疫機能低下的患者患侵襲性曲霉菌病日趨增多. 體內外實驗顯示糖皮質激素在免疫和炎癥應答中有促進和抑制作用，甚至出現雙向作用［3］. 為了解糖皮質激素對TLRs表達的影響，我們以甲基強地松龍為免疫抑制劑，在誘導小鼠免疫抑制后檢測腹腔巨噬細胞TLRs mRNA的表達情況.
1材料和方法
1.1材料
Balb/c小鼠24只，雌性，6～8周齡，體質量20～25g（第四軍醫大學實驗動物中心）. 總RNA提取試劑TRIZOL Reagent（Gibco公司），MMLV Reverse Transcriptase 和Reverse Transcription System(Promega 公司)，Taq DNA聚合酶和dNTPs(TaKaRa公司)，不完全RPMI1640( Life Technology公司)，甲基強的松龍，40 mg/支(比利時法瑪西亞普強公司).
1.2方法
1.2.1糖皮質激素誘導小鼠免疫抑制及腹腔巨噬細胞計數
將免疫抑制組小鼠12只皮下注射甲基強的松龍100 mg/kg·d， 共3 d. 正常對照組小鼠12只皮下注射同體積注射用水. 第4日脫頸處死小鼠，浸泡于750 mL/L 乙醇1 min，剪開腹部皮膚，暴露腹部，用注射器吸取5 mL無血清RPMI1640培養液注入腹腔，輕揉腹腔1～2 min，用吸管吸取腹腔巨噬細胞懸液，移入離心管中計數.
1.2.2細胞總RNA的提取
收集腹腔巨噬細胞懸液，2000 g離心10 min，棄上清，RPMI1640洗滌1次. 用TRIZOL Reagent一步法提取巨噬細胞總RNA.
1.2.3TLR1~13 PCR引物
根據GenBank公布的TLR1～13（除TLR10）已知序列設計引物，由上海生工生物工程技術服務公司合成（表1）. 表1基因名稱和序列（略）
1.2.4RTPCR擴增TLR1～13基因及內參照βactin基因按照說明書，以Random Primers為引物，將從小鼠腹腔巨噬細胞中提取的總RNA逆轉錄合成cDNA. 分別用TLR及內參照βactin兩組引物進行PCR擴增，反應條件為：95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30s，循環32次，延伸7 min.
1.2.5擴增產物檢測取10 μL PCR產物，15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳40 min，隨后在凝膠成像系統中分析電泳帶的吸光度值. TLRs的相對含量為TLRs與內參βactin吸光度比值表示.
統計學處理：實驗結果以x±s表示，兩組間差異比較用t檢驗，多組間比較采用KruskalWallis H檢驗.
2結果
2.1小鼠腹腔巨噬細胞數量變化將甲基強的松龍注射后，小鼠腹腔巨噬細胞數量由（6.3±1.8）×106/只降至（3.2±0.6）×106/只，前后比較有統計學差異（P
2.2TLR113在正常小鼠腹腔巨噬細胞的表達經RTPCR檢測，TLR113在小鼠腹腔巨噬細胞均有表達(圖1).
2.3免疫抑制狀態下小鼠腹腔巨噬細胞TLRs的表達變化糖皮質激素可上調巨噬細胞上部分TLRs mRNA表達(圖1)，包括TLR2，3，4，5，6，8. 表達量增加約1.2～2.0倍(表2). 若
3討論
TLRs在不同組織細胞的表達各異 ，可分為廣泛表達、限制性表達或特異性表達［4］，如TLR1分布于各類免疫細胞，TLR2，4，5只在髓源性細胞表達，TLR3則主要表達于樹突狀細胞. 小鼠腹腔巨噬細胞為常駐巨噬細胞，是防御病原微生物入侵的第一道防線. Muzio 等［5］研究顯示， 單核/巨噬細胞在發育成熟的不同階段表達大多數TLRs，但不表達TLR3. 我們的結果證明TLR113在小鼠腹腔巨噬細胞均有表達，包括TLR3. 當局部受到細菌、真菌及病毒感染時，巨噬細胞上的TLRs可識別不同的病原體相關分子模式如細菌脂肽、dsRNA，LPS和細菌鞭毛等并被活化，提供迅速而有效的先天免疫應答并啟動獲得性免疫應答.
多種病原微生物成分或細胞因子可上調或下調TLRs表達，如LPS可誘導TLR2，TLR4及TLR9的表達，IL6可使TLR7的表達明顯升高，INFγ可上調TLR9的表達. Renshaw等［6］研究證實，老齡小鼠的脾細胞和腹腔巨噬細胞TLR1～9的表達顯著減少，且TLRs功能下降，這可能部分解釋老年人對各種病原菌感染的易感性增加. 糖皮質激素是廣泛應用的抗炎劑，其抗炎效應的發揮是通過下調依賴NFκB的大量炎癥應答相關基因的轉錄，而TLRs的上調可誘導NFκB的活化［7］. 研究發現，大劑量應用糖皮質激素是機會性真菌易感的主要危險因素之一，理論上推測糖皮質激素可能下調TLRs表達. 我們的結果顯示，甲基強的松龍在mRNA水平上調巨噬細胞部分TLRs表達，其調節機制還不十分清楚. Homma等［8］研究了地塞米松對呼吸道上皮細胞TLRs家族成員表達的調節，發現地塞米松可上調TLR2～6的表達，與我們的研究結果相一致. Shuto等［7］研究證實，地塞米松協同增強非典型流感嗜血桿菌誘導的TLR2上調，是通過p38MAPK信號途徑的負調節. Franchimont等［9］將地塞米松加入LPS刺激的全血細胞培養中，發現地塞米松可增加IL10的分泌，而降低TNFα的分泌，證明了糖皮質激素可強烈抑制Th1細胞促炎因子的分泌，而對Th2細胞抗炎因子的分泌有正調節作用. 糖皮質激素對巨噬細胞部分TLRs有上調作用，免疫功能低下患者易發生機會性感染，但究竟是通過對Toll樣受體信號通路中哪些環節的抑制而發揮作用的？糖皮質激素上調部分TLRs表達的準確分子機制是什么？這將有待于進一步研究.
以往研究認為，糖皮質激素可明顯改變單核巨噬細胞的功能，能抑制巨噬細胞的吞噬和加工處理抗原功能，阻止單核細胞分化為巨噬細胞. 我們在實驗中觀察到糖皮質激素甲基強的松龍對巨噬細胞的毒性作用，甲基強的松龍注射后可導致小鼠腹腔巨噬細胞明顯減少，RAW264.7細胞經甲基強的松龍作用后細胞生長受到抑制甚至死亡. 尚未見文獻報道糖皮質激素對巨噬細胞的直接毒性作用，甲基強的松龍抑制巨噬細胞生長或誘導死亡可能是免疫抑制小鼠對煙曲霉菌易感的機制之一.
【參考文獻】
［1］Bellocchio S， Montagnoli C， Bozza S， et al. The contribution of the Tolllike/IL1 receptor superfamily to innate and adaptive immunity to fungal pathogens in vivo［J］. J Immunol， 2004 ，172(5):3059-3069.
［2］Ashwell JD， Lu FW， Vacchio MS. Glucocorticoids in T cell development and function［J］. Annu Rev Immunol， 2000，18:309-345. Review.
［3］Galon J， Franchimont D， Hiroi N， et al. Gene profiling reveals unknown enhancing and suppressive actions of glucocorticoids on immune cells［J］. FASEB J， 2002，16(1):61-71.
［4］Zarember KA， Godowski PJ. Tissue expression of human Tolllike receptors and differential regulation of Tolllike receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes， their products， and cytokines［J］. J Immunol， 2002，168(2):554-561.
［5］Muzio M， Bosisio D， Polentarutti N， et al. Differential expression and regulation of tolllike receptors (TLR) in human leukocytes: selective expression of TLR3 in dendritic cells［J］. J Immunol， 2000，164(11):5998-6004.
［6］Renshaw M， Rockwell J， Engleman C， et al. Cutting edge: impaired Tolllike receptor expression and function in aging［J］. J Immunol， 2002，169(9):4697-4701.
［7］Shuto T， Imasato A， Jono H， et al.. Glucocorticoids synergistically enhance nontypeable Haemophilus influenzaeinduced Tolllike receptor 2 expression via a negative crosstalk with p38 MAP kinase［J］. J Biol Chem， 2002，277(19):17263-17270.
［8］Homma T， Kato A， Hashimoto N， et al. Corticosteroid and cytokines synergistically enhance tolllike receptor 2 expression in respiratory epithelial cells［J］. Am J Respir Cell Mol Biol， 2004，31(4):463-469.
關鍵詞：巨噬細胞；魚紅細胞；實驗方法；吞噬
中圖分類號 G642.0 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）23-17-02
高等動物體內的巨噬細胞、單核細胞和中性粒細胞等多具有吞噬功能，均由骨髓干細胞分化而來，是機體非特異性免疫功能的重要組成部分。當病原微生物或其他異物侵入機體時，由于巨噬細胞具有趨化性，便向異物處聚集，巨噬細胞可將之內吞入胞質，形成吞噬泡，然后在胞內與溶酶體融合，將異物消化分解，這在機體非特異性免疫中具有重要意義。靜息的巨噬細胞吞噬功能低下，只有活化狀態下的巨噬細胞才具有較強的吞噬能力。現在所用細胞實驗教材[1-4]所編列吞噬實驗大多用雞紅細胞、羊紅細胞、墨水、桿菌[5]、熒光微球等作為吞噬物，本文首次使用魚血細胞作為吞噬物，對小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬效果進行了探索和研究，以期避免使用家禽作為實驗材料，并進一步完善了實驗方法。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 魚血紅細胞稀釋液的制備 從市場上購買鯽魚，用注射器尾靜脈采血，或解剖后從魚血竇或心臟抽取魚血。抽取的魚血，不添加抗凝劑，直接用無血清L15培養基（Gibco，invitrogen Corporation），稀釋10倍。配成10%魚血紅細胞懸液備用。
1.1.2 3%可溶性淀粉溶液的制備 稱取可溶性淀粉3g，溶于100mL生理鹽水中，混勻后121℃高壓滅菌20min備用。
1.2 方法
1.2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的誘導 在實驗前3d，連續3d定時給小鼠腹腔注射3%淀粉液。注射部位在腹部中央，持針以45°斜角刺入，注意勿傷及內臟或注入腸內，注射后揉動腹部，分散淀粉粒，并觀察注射后動物狀態，以免小鼠死亡。
1.2.2 魚紅細胞的注射及腹腔液的收集 實驗時，小鼠腹腔注射10%魚紅細胞懸液1mL，輕按小鼠腹部，使懸液分散。60min后，用頸椎脫臼法處死小鼠。將小鼠腹面朝上，于腹部中央用有齒尖鑷夾起皮膚層，用剪刀剪一環口，撕開腹部皮膚，充分暴露腹膜。此時，向腹腔注射1mL生理鹽水，并輕揉腹部片刻。隨后用剪刀剪開腹膜成一縱形口，用鑷子將兩邊皮膚夾起來，以防腹腔液流出。把內臟推向一側后，可用不裝針頭的注射器或吸管吸取腹腔液，小心操作，以免腹腔內血管破裂，吸取到小鼠腹腔外周血細胞。
1.2.3 制片及染色方法 取腹腔液滴于潔凈的載玻片上，按血涂片制備法制備細胞涂片。空氣干燥后，載片放入100%甲醇液的固定缸中固定5min。固定后的載片，采用扣染法，即用牙簽架起載片，細胞面朝下反扣在玻板上，用Giemsa染色液（Giemsa原液1份，0.075mol/L磷酸緩沖液9份）染色載片，染色時間為20min。染色完成后，揭起載片，用滴管吸取蒸餾水輕緩沖洗載片，洗去多余的染液。
1.2.4 顯微觀察及吞噬百分率和吞噬指數的計算 載片空氣干燥后，在OLympus BX41顯微鏡下觀察，用DP70攝像頭進行顯微拍攝，并用IPP5.0軟件進行顯微照片標尺標記。40倍物鏡下已能觀察到游離的魚紅細胞及吞噬魚紅細胞的巨噬細胞。實驗共用小鼠5只，實驗過程中未出現死亡，每只小鼠制備5片涂片。每片隨機觀察數個視野，記錄100個吞噬細胞的吞噬結果，計算吞噬百分率、吞噬指數。吞噬百分率（%）=吞噬魚紅細胞的巨噬細胞數/計數的總巨噬細胞數（吞噬及未吞噬的）×100。吞噬指數=巨噬細胞中所吞噬的魚紅細胞數/計數的總巨噬細胞數。
2 實驗結果
2.1 巨噬細胞吞噬狀態 在普通光學顯微鏡下，可清晰觀察到主要的三類細胞，魚紅細胞、未吞噬魚紅細胞的巨噬細胞（圖1中1）及吞噬一個或數個魚紅細胞的巨噬細胞（圖1中2～4）。鯽魚紅細胞多為長橢圓形，核常位于細胞中部，胞核染為深紫色。巨噬細胞大多呈不規則形狀，胞體表面不光滑，常有突觸，細胞核較大，呈腎形、圓形或其他不規則形狀，染為紫紅色。巨噬細胞吞噬魚紅細胞，常能觀察到以下幾種吞噬狀態：巨噬細胞內魚紅細胞膜仍完整；巨噬細胞內魚紅細胞膜不完整或破裂；巨噬細胞內具有一個或數個大小不等的魚紅細胞細胞核；還可觀察到巨噬細胞膜凹陷，魚紅細胞緊貼在凹陷處正在被吞噬。圖1顯示激活狀態的巨噬細胞及多種吞噬魚紅細胞的狀態。
2.2 吞噬率和吞噬指數 實驗測得小鼠腹腔巨噬細胞吞噬魚紅細胞的吞噬率為25.0%，吞噬指數為0.31。與雞紅細胞的吞噬率和吞噬指數相近[6-7]。
3 討論
小鼠腹腔巨噬細胞吞噬實驗是生物科學及醫學專業本科層次細胞生物學課程開設的實驗必修項目。近年來，由于禽流感[8]的流行，細胞生物學教學實驗室通過多次試驗、反復摸索和研究“小鼠腹腔巨噬細胞吞噬實驗”這一實驗內容，在傳統方法的基礎上不斷改進。主要的改進有以下3個方面：一是采用小鼠實驗前連續3d定時免疫，有效增加了腹腔內處于激活狀態的巨噬細胞數量。二是取魚血紅細胞作為吞噬物，且所取魚血不用添加抗凝劑，直接用不加血清的L15細胞培養液來稀釋血細胞，實驗效果明顯，完全符合實驗要求。三是染色方法的好壞直接關系到對實驗結果的觀察，本實驗應用Giemsa染色扣染法，巨噬細胞及魚紅細胞染色均清晰，細胞的形態結構更加明顯，能有效地分辨各類細胞的細胞核、細胞漿及吞噬魚紅細胞的各種狀態。此實驗方法已用于我院本科生實驗教學，師生們普遍認為實驗結果便于學生觀察和計數，有助于學生對吞噬細胞吞噬作用的理解和掌握，提高教學效果。
綜上所述，采用魚血細胞作為吞噬物，實驗結果明顯，吞噬率及吞噬指數均高于或接近于雞紅細胞的數據，并進一步完善了實驗方法，實驗結果更直觀與清晰。同時巨噬細胞吞噬實驗常用于免疫增強藥物活性的測定，其中以體內法最能反應實際吞噬能力，這一方法常用雞紅細胞來進行測定，是否也可用便于取材的魚紅細胞來測定，值得進一步實驗和探討。
參考文獻
[1]李素文.細胞生物學實驗指導[M].北京：高等教育出版社，2001.
[2]王金發，何炎明.細胞生物學實驗教程[M].北京：科學出版社，2004.
[3]桑建利，譚信.細胞生物學實驗指導[M].北京：科學出版社，2010.
[4]楊漢民.細胞生物學實驗?二版[M].北京：高等教育出版社，1997.
[5]朱兆玲，周紅，李美玉，等.吞噬細胞吞噬作用實驗方法的改進[J].臨床醫學工程，2012，19（4）：524-525.
[6]張華，曲震寰，王瑩，等.小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養與吞噬功能測定[J].黑龍江醫藥科學，2007，30（5）：9.
[7]湯城，薛雅蓉，余飛，等.一種檢測巨噬細胞吞噬雞紅細胞活性新方法的建立[J].畜牧與獸醫，2005，37（11）：47-48.
瀘州醫學院附屬醫院整形燒傷科，四川瀘州646000
[摘要] 中性粒細胞、巨噬細胞在整個燒傷免疫過程中起者重要作用。所以弄清嚴重燒傷后中性粒細胞、巨噬細胞的功能變化及其所帶來的影響對預防燒傷后并發膿毒血癥、多器官功能衰竭顯得尤為重要。現將嚴重燒傷后中性粒細胞、巨噬細胞的功能變化及其影響作一綜述。
關鍵詞 燒傷；中性粒細胞；巨噬細胞
[中圖分類號] R644.02[文獻標識碼] A[文章編號] 1674-0742（2014）04（b）－0195-02
[作者簡介]賴曉敏（1987.7-），男，四川人，碩士， 主要從實整形燒傷工作。
嚴重燒傷后并發膿毒血癥、多器官功能衰竭是目前燒傷重要的死亡原因之一，其病情發展快，死亡率極高。是目前燒傷治療所面臨的一個巨大挑戰[1-3]。究其本質是有炎癥因子所介導的全身炎癥反應綜合征（SIRS）。而中性粒細胞（Polymorphonuclear neutrophils，PMN）、巨噬細胞（Macrophages，m）在整個過程中起著重要作用。所以弄清嚴重燒傷后PMN、巨噬細胞的功能變化及其所帶來的影響對預防燒傷后并發膿毒血癥、多器官功能衰竭顯得尤為重要。現將嚴重燒傷后PMN、巨噬細胞的功能變化及其影響作一綜述。
1中性粒細胞的生理特點和功能
PMN是外周血含量最多的白細胞，具有變形、游走、趨化、吞噬和分泌等特性。①PMN能伸出偽足做變形運動，通過這種運動，PMN得以穿過毛細血管壁。②滲出到血管外的PMN可以借助變形運動在組織內游走。③在趨化因子的作用下PMN可以朝向某些特定的化學物質運動。這些趨化因子包括兩大類：外源性趨化因子和內源性趨化因子。外源性趨化因子包括：可溶性細菌產物（含有N-甲酰基蛋氨酸末端的多肽）。內源性趨化因子包括：補體成分（如C5a）、白三烯、細胞因子（IL18）等。④PMN到達炎癥病灶后，通過其細胞質內的嗜天青顆粒和特異性顆粒所含有的水解酶、中性蛋白酶、MPO、陽離子蛋白、溶酶菌乳貼蛋白及堿性磷酸酶將細菌殺滅。⑤PMN在趨化、吞噬過程中還可釋放溶酶體酶、活性氧自由基、前列腺素，白三烯等損傷內皮細胞和組織，加重原有的損傷。
2巨噬細胞的生理特點和功能
巨噬細胞是由未發育成熟的單核細胞遷入組織中繼續發育而成的具有吞噬和免疫功能的細胞。其細胞體積較大，可達60~80 μm，溶酶體顆粒和線粒體數目增多。因此，巨噬細胞的吞噬能力強，可吞噬更多更大的細菌和顆粒。①免疫功能：巨噬細胞能合成和釋放多種細胞因子，包括CSF、白細胞介素（IL-1、IL-3、IL-6、IL-18），腫瘤壞死因子、干擾素等。有研究表明，巨噬細胞可提高HLADR-CD86 等抗原提呈分子的表達，釋放單核細胞趨化因子MCP-1，TNF -a等多種炎癥因子，誘導和活化其他炎性細胞，在炎癥反應中起著重要作用[4]。②吞噬功能：能夠吞噬病原體和壞死細胞，有助于啟動康復過程。巨噬細胞吞噬病原體和壞死細胞的過程包括識別、吞入、殺傷和降解。巨噬細胞通過細胞表面的非特異性受體吞噬病原菌和壞死細胞。巨噬細胞是通過介導吞噬的相關受體與微生物表面接觸，從而啟動復雜的信號通道，通過細胞骨架的重排和膜的輸送介導對微生物細胞吞噬效應[5-6]。當病原菌進入吞噬溶酶體后可被依賴和非依賴氧途徑殺傷和降解。
3嚴重燒傷后中性粒細胞功能的變化及其影響
PMN在整個炎癥反應發生過程中起著重要作用，嚴重燒傷后PMN不僅可以穿過血管壁聚集到損傷區域， 吞噬異物、殺滅細菌[7]，還可直接釋放炎癥介質，且與內皮細胞黏附后可造成自身組織損傷[8]。①嚴重燒傷后PMN延遲凋亡。有研究表明[9-12]，嚴重燒傷后PMN的凋亡發生延遲，而延遲凋亡的PMN可發生繼發性壞死，釋放大量炎性物質，導致炎癥反應的擴大，促發全身炎癥反應綜合征（SIRS），導致局部和全身的組織損傷甚至臟器的損傷。②PMN的趨化功能改變。PMN趨化因子包括：病原菌、補體C3a、C5a、C、纖維蛋白降解產物、纖維肽B和血管舒緩素等。嚴重燒傷后，PMN的趨化性立即增加，主要是因為不耐熱刺激活動的增加，然后其趨化性逐漸減弱。而PMN趨化性減弱的時間出現越早，其持續時間將越長。有研究表明[13]燒傷后創面應用磺胺嘧啶銀的患者，其血清對正常人PMN的趨化性有抑制作用。實驗證明，IL-18能夠促進PMN的趨化作用[14]。腹腔注射IL-18后，能夠增加腸道PMN的浸潤，導致腸道組織水腫[15]。③嚴重燒傷后PMN的吞噬功能明顯下降，早期吞噬細胞的吞噬指數和吞噬細胞百分率下降，一周左右恢復。有文獻報道[16]大鼠5Gy60Coγ射線全身照射復合15%TBSAⅢ度光輻射燒傷后，PMN的吞噬功能明顯降低。④中性粒細胞的殺菌功能改變。當病原菌被PMN吞噬后，主要通過氧依賴過程和氧不依賴過程進行細胞內殺滅細菌。有實驗證明[17]燒傷后各種因素均可激活中性粒細胞，如壞死組織、缺血、缺氧、炎癥介質和細胞因子等。不但可使PMN生成增加，也使外周血中成熟的PMN游出血管，PMN到達創傷部位可釋放出氧自由基、蛋白水解酶等起著殺菌作用，同時也造成組織新的損傷，表現為創面的加深和擴大。
4嚴重燒傷后巨噬細胞功能的變化及其影響
人體具有免疫功能的細胞主要包括嗜PMN、單核巨噬細胞和淋巴細胞等。其數量和功能與感染密切相關，而在這些免疫細胞中，M發揮著極其重要的作用。燒傷后巨噬細胞活化，分泌能力增強， 大量釋放炎癥介質，是引起全身炎癥反應綜合征的原因之一。（1）燒傷后部分巨噬細胞的表型可發生改變。有實驗證明：①燒傷后巨噬細胞產生一氧化氮的量增加。Schwacha等[18]證明，燙傷小鼠的脾臟巨噬細胞誘導型一氧化氮合成酶活性增加。②巨噬細胞產生PGE2的量呈明顯增加[19]。③燙傷小鼠脾臟巨噬細胞中誘導型環氧化酶2（COX-2）的活性增加[20]。④燒傷后巨噬細胞產生IL-10的量增加。以上均提示燙傷引起了巨噬細胞表型的變化。（2）嚴重燒傷后M的免疫功能改變：研究表明[21]，燒傷后巨噬細胞被激活，巨噬細胞實現抗原提呈功能的人白細胞DR抗原的表達率明顯下降，下降的程度及所持續的時間與燒傷嚴重程度有關。目前認為：當DR抗原表達率不足30%時，可認為單核細胞免疫麻痹[22]。（3）燒傷后巨噬細胞的吞噬能力增強：實驗證明[23]：兔角膜堿燒傷后，腹腔巨噬細胞的體積明顯增大，吞噬能力顯著增強。在燒傷后9周內，其對異物性細胞的吞噬率及吞噬指數明顯高于燒傷前。
5結論
以上研究表明燒傷后PMN、巨噬細胞的功能發生了一系列復雜的變化，其在全身炎癥反應綜合征，燒傷后并發膿毒血癥，多器官功能衰竭中都起著重要作用。弄清其功能的變化及其所帶來的影響對預防燒傷后并發膿毒血癥、多器官功能衰竭尤為重要。但目前尚缺乏有效控制或恢復燒傷后PMN、巨噬細胞功能的藥物或技術手段。一些功能改變的機制尚待進一步研究。
參考文獻
[1]Cummings MC，Winterford CM，Walker NI．Apoptosis[J]．Am J Surg Pathol，1997，21（1）：88-101．
[2]Vaux DL，Korsmeyer SJ．Cell death in development[J]．Cell，1 999，96（2）：245-254．
[3]Krueger A，Baumann S，Krammer PH，et al．FLICE—inhibitory proteins：regulators of death receptor-mediated apoptosis[J]．Mol Cell Biol，2001，21（24）：8247-8254．
[4]MooreKJ，TabasI. Macrophage in the pathogenesis of atheroscierosis[J].CeII，2011，145：341-355.
[5]Underhill DM， Ozinsky A. Phagocytosis of microbes： complexity in action[J].Annu Rev Immunol，2007，20：825-852.
[6]Rosenberger CM，Finlay BB.Phagocyte sabotage.disruption ofmacroph-age signaling by bacterial pathogens[J].Nat RevMol Cell Biol，2003，4：385-396.
[7]王世筠， 許偉石. 燒傷急性期中性粒細胞的激活[J].國外醫學：創傷與外科基本問題分冊，1998，19（3）：151-155.
[8]Koike K， Moore EE， Moore FA， et al.CD11bblockade prevents lung injury despite neutrophil priming aftergut ischemia reperfusion[J].J Trauma，2005，39：23.
[9]Chlmis D，Dickemon C，Munster AM，et al Fapopto．is in polymorphonuclear neutmphil^如mh patients[J]．J Leukoc Bid，2006，59（6）：835-839．
[10]張丕紅，馬恩慶，黃曉元，等．家兔燙傷早期中性粒細胞凋亡變化[J]．中華外科雜志，2003，37（12）：771-773．
[11]張丕紅，馬恩慶，黃曉元，等．燒傷病人早期血清和刨面水腫液對中性粒細胞凋亡的影響[J]．中華燒傷雜志，2006，16（2）：100-103．
[12]李志清，黃躍生，楊宗城．嚴重燒傷早期大鼠中性粒細胞、巨噬細胞凋亡實驗研究[J]．中華燒傷雜志，2001，t7（3）：171-173．
[13]王學義，方云山，秦云良.等.施普瑞對重度燒傷患者血液中白細胞總數及分類的影響[J]．實用醫藥雜志，1996，9（4）：34-35．
[14]Jordan J A，Guo R F，Yun E C，et al． Role of IL-18 in acute lung inflammation[J]．J Immunol，2007，167（12）：7060-7068．
[15]Li X，Schwacha MG，Chaudry I H，et al．Acute alcohol intoxicationpotentiates neutrophil-mediated intestinal tissue damage after burn injury [J]．Shock，2008，29（ 3）：377－383．
[16]舒崇湘，陳宗榮，王松寶．大鼠5Gy照射復合15％Ⅲ度燒傷后中性粒細胞吞噬功能變化及其機理研究[J].第三軍醫大學學報，2005，17（1）：24-28．
[17]A rtu rsonG. Pathophys iology of the bu rnw ound and pharm acolog icaltreatm ent. Th e RudH erm ans Lectu re[J].Burns，2006，22（4）：255-274.
[18]SchwachaMG， Chaudry IH. The cellularbasisof post-burn immunosuppression.macrophages and mediators （review）[J].Int J Mol Med，2002，10：239-243.
[19]Ogle CK，Mao JX，Wu JZ，et al.The 2004 lindberg award.The production of tumor necrosis factor， interleukin-1， interleukin-6， and prostaglandin E2 by isolated enterocytes and gut macrophages：effect of lipopolysaccharide and thermal injury[J].J Burn Care Rehabil，2004，15：470-477.
[20]Schwacha MG，Chung CS，Ayala A， et al.Cyclooxygenase 2-mediatedsuppression ofmacrophage interleutin-12 production afterthermal injury[J].Am J Physiol Cell Physiol，2002， 282：263-270.
[21]劉靜杰，胡森，董寧，等.嚴重燒傷病人外周血單核細胞表面人白細胞DR抗原變化的初步研究[J].中國危重病急救醫學，2003，15（1）：23-25．
[22]HansDV，Petra R，WoflD. Clinical aspects： from systemic inflammation to immunoparalysis[J].ChemImnunol，2000，74（6）：162-177．
關鍵詞：氨氯地平；氧化低密度脂蛋白；基質金屬蛋白酶-9；穩定斑塊
中圖分類號：R972 文獻標識碼：A 文章編號：1672-1349（2012）01-0073-02
冠狀動脈粥樣硬化斑塊由穩定轉為不穩定，繼而破裂導致血栓形成，是急性冠脈綜合征（ACS）最主要的發病機制［1］。基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP- 9)是MMPs家族中的重要成員，是細胞外基質(extracellular matrix,ECM)代謝的關鍵酶之一,在動脈粥樣斑塊處的血管重構、斑塊的不穩定及破裂誘發的ACS中都起著十分重要的作用［2］。
氨氯地平（Amlodipine）是廣泛用于臨床的第三代新型長效二氫吡啶類鈣通道阻滯劑(calcium channel blockers,CCB)，臨床上主要應用于高血壓治療的一線用藥。
1 材料與方法
1.1 研究對象 健康成人靜脈血液來自山西醫科大學第二臨床醫院體檢中心；人淋巴細胞分離液（Lymphocytes Separation Medium1077）為上海華精生物高科技有限公司產品；RPMI-1640培養液；胎牛血清為杭州四季青公司產品；佛波酯購自美國SIGMA公司；氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）為北京協生生物科技有限公司產品；FITC-CD14抗體購自日本Beckman Coulter公司。RNA提取試劑盒（TransZol）購自北京全式金生物技術公司；逆轉錄-多聚酶聯反應（RT-PCR）試劑盒購自北京全式金生物技術公司；引物序列由上海生工生物有限公司合成；酶聯免疫（ELISA）試劑盒購自美國R＆D公司；氨氯地平為輝瑞公司饋贈。
1.2 巨噬細胞分離、培養、誘導和鑒定 取肝素抗凝靜脈血30 mL分裝到10個離心管，用RPMI-1640液稀釋1倍并充分混勻，分別緩慢加入等比例淋巴細胞分離液于離心管中，2000 r/min離心20 min后，吸取中間環狀云霧狀淋巴細胞層，再以3 mLPBS液充分混勻，1 500 r/min離心洗滌2次；用含10%胎牛血清的RPMI-1640各5 mL將細胞吹開混勻，取細胞懸液至培養瓶，每瓶4 mL，于37 ℃、5%CO2培養箱中孵育，培養至4代后于細胞指數生長期進行誘導轉化實驗。誘導轉化時，以40 ng/mL的PAM無胎牛血清RPMI-1640培養液繼續培養48h～72 h，待細胞轉化為巨噬細胞后以RPMI-1640培養液洗滌3次，置于10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中繼續培養48 h。臺盼藍染色法測定細胞存活率。用特異性熒光素標記的CD14細胞表面抗體行流式細胞術進行單核細胞源性巨噬細胞鑒定。
1.3 試驗分組 試驗共分5個組。空白對照組，不進行任何干預，僅單獨培養單核巨噬細胞24h；ox-LDL對照組，只加入ox-LDL 100 mg/mL孵育24 h；試驗三組分別加入100 mg/mL ox-LDL孵育2 h后，再分別加入氨氯地平低劑量0.1 μmol/L;中劑量1.0 μmol/L;高劑量10.0 μmol/L培養24 h。
1.4 半定量RT-PCR檢測MMP-9mRNA的表達水平
1.4.1 RNA提取 棄培養瓶中的培養液，每瓶加入1.0mLTrizol，依次加入氯仿、異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌后略晾干，溶于25 μL DEPC中。核酸紫外分析儀檢測，根據260/280比值，所有樣品A260/A280比值1.9~2.0。并根據260 nm 的吸光度值對樣品的總RNA進行初步定量,確定樣品中RNA純度和含量。
1.4.2 反轉錄反應 反轉錄反應在20 μL體系中進行：含1 μg RNA，20 mg/L的oligo（dT）引物，1.0 mml/L dNTP，20 U Rnase抑制劑，1×Buffer，200UM-MLV反轉錄酶。于PCR儀上42 ℃反應1 h，72℃滅活10 min后保存于-20 ℃冰箱中。
1.4.3 PCR擴增反應 MMP-9上游引物序列為：5′-TCCCTGGAGACCTGAGAACC-3′；下游引物序列為：5′-GGCAAGTCTTCCGAGTAGTTT-3′。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環29次；末次延伸7 min，產物長度為307 bp。B-actin上游引物序列：5′-CCTGAGGCACTCTTCCAG-3′,下游引物序列：5′-TCACACTTCATGATGGA-3′,產物大小100 bp。
1.4.4 凝膠電泳 取PCR產物10 μL在瓊脂糖凝膠上電泳，計算機凝膠成像系統掃描拍照，Toptal軟件分析灰度值，以各條帶與β-actin內參條帶灰度比值，代表MMP-9 mRNA轉錄水平。
1.5 酶聯免疫吸附雙抗體夾心法測定MMP-9蛋白含量 取六孔培養板上清液進行酶聯免疫吸附雙抗夾心法（enzyme linked immuno-sorbent assay,ELISA）測定，每組重復6次。
1.6 統計學處理 計量資料以均數±標準差（x±s）表示，用SPSS 13.0建立數據庫,采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。
2 結 果
2.1 ox-LDL誘導的單核巨噬細胞MMP-9 mRNA表達 與空白對照組比較，ox-LDL各組MMP-9 mRNA表達明顯增加（P＜0.05）；與ox-LDL對照組比較，不同劑量氨氯地平組MMP-9 mRNA表達明顯降低（P＜0.05）；ox-LDL誘導后，不同劑量氨氯地平各組之間比較，隨著氨氯地平劑量增加，MMP-9 mRNA表達逐漸降低（P＜0.05）。詳見表1。
2.2 ox-LDL誘導的單核巨噬細胞MMP-9蛋白表達 與空白對照組比較，ox-LDL對照組MMP-9蛋白表達明顯增加（P＜0.05）；與ox-LDL對照組比較，不同劑量氨氯地平組MMP-9蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。 ox-LDL誘導后的不同劑量氨氯地平組之間比較，隨著氨氯地平劑量增加MMP-9蛋白表達逐漸降低（P＜0.05）。詳見表1。
3 討 論
心血管疾病病理基礎是動脈粥樣硬化，而血栓的形成與炎癥反應在動脈粥樣硬化的形成和發展過程中的作用非常重要。冠狀動脈粥樣硬化斑塊由穩定轉為不穩定，繼而破裂導致血栓形成，是急性冠脈綜合征最主要的發病機制［1］。粥樣硬化斑塊破裂以及血栓介導的急性心肌梗死最重要的決定因素是斑塊的組成成分,單核巨噬細胞的聚集，以及合成MMPs的增多和/或內源性基質金屬蛋白酶抑制物減少，是造成粥樣斑塊纖維帽厚度和抗損傷強度降低，斑塊穩定性下降的重要因素［3］。
基質金屬蛋白酶降解細胞外基質致纖維帽變薄破裂，是急性冠脈綜合征臨件發生的重要原因,MMP-9是其中重要一員［4］。MMP-9由活化的巨噬細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞等以蛋白酶原前體的形式從細胞內分泌到細胞外，MMP-9的作用底物有明膠、Ⅳ型和Ⅴ型膠原、蛋白聚糖、彈性蛋白。MMP-9活性增強可導致膠原裂解增加［5］。在動脈粥樣硬化斑塊局部,MMPs主要來源于激活的巨噬細胞和泡沫細胞。近年來有研究發現,在人動脈粥樣硬化斑塊容易發生破裂的部位(尤其是斑塊肩部和脂質核處) ,MMP-1、MMP-2、MMP-9 和MMP-3 活性均有增高［6］。
氧化低密度脂蛋白作為獨立的危險因素在動脈粥樣硬化的發生發展及急性冠脈綜合征形成中占有重要的地位，在動脈粥樣硬化中ox-LDL除了直接導致內皮損傷外，還可以引起單核細胞趨化、巨噬細胞源泡沫細胞形成和細胞毒性產生 ,并且可以調節粥樣斑塊內血管內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞等多種細胞和生長因子的合成［7］。ox-LDL 可增加單核細胞源巨噬細胞MMP-9 的蛋白表達并增強其活性，是細胞功能和基因表達的主要調節因子［8］。
氨氯地平可能機制有抗氧化、抗炎、改善內皮功能、抑制血管平滑肌增殖與遷移、保持斑塊穩定性等［9］。
本研究用ox-LDL誘導人單核巨噬細胞24 h后，與單核巨噬細胞組相比，MMP-9mRNA及其蛋白表達增加，與文獻報道一致；ox-LDL誘導人單核巨噬細胞2 h后，加入不同劑量的氨氯地平，與ox-LDL空白對照組相比，MMP-9的表達減少且與氨氯地平的劑量有濃度劑量依賴關系。氨氯地平可通過抑制ox-LDL誘導的人單核巨噬細胞MMP-9的表達，發揮穩定粥樣斑塊和抗炎的作用，減少急性冠脈事件的發生，但其通過何種途徑減少MMP-9的表達，還有待進一步研究。
參考文獻：
［1］ Libby P，Theroux P.Pathophysiology of coronary artery disease［J］.Circulation,2005,111:3487-3488.
［2］ Yla-Hrttuala S,Lipton BA,Rosenfeld ME,et al.Expression of monocyte chemoattractan protein-1 in maceophage-rich areas of human and rabbit atherosclerosis lesions［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(12):5252-5256.
［3］ Newby AC.Dual role of matrix metalloproteinases (matrixins) in intimal thickening and atherosclerotic plaque rupture［J］.Physiol Rev,2005,85(1):1-31.
［4］ Shah PK,Falk E,Badimon JJ,et al.Human monocyte derived macrophages induce collagen breakdown in fibrous caps of atherosclerotic plaques.Potential role of matrix-degrading metalloproteinases and implications for plaque rupture［J］.Circulation,1995,92(6):1565-1569.
［5］ Nonoto K,Oguchis W,Alanabn,et al.Involvement of inflamrnation in acute coronary syndormes assessed by levels of high-sensitive C-reactive protein,matrix metalloproteinase-9 and soluble vascular-cell adhesion molecule-1 ［J］.J Cardio1,2003,42(5):201-206.
［6］ Galis ZS,Sukhova GK,Lark MW,et al.Increase expression of matrix metalloproteinases and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atherosclerotic plaques［J］.J Clin Invest,1994,94(6):2493-2503.
［7］ Steinberg D.Oxidative modification of LDL and atherogenesis［J］.Circulation,1997,95(4):1062-1071.
［8］ Xu XP,Meial SR,Ong JM,et al.Oxidized low density lipoprotein regulates matrix metalloproteinase-9 and its tissue inhibition in human monocyte-derived macrophages［J］.Circulation,1999,99(8):993-998.
［9］ 徐麗梅，涂玉林.氨氯地平抗動脈粥樣硬化研究進展［J］.中國動脈粥樣硬化雜志,2008，3(15):241-243.
巨噬細胞移動抑制因子（MIF）是一種重要的前炎癥因子，主要作用為抑制巨噬細胞的游走移動，促進巨噬細胞在炎癥局部浸潤、聚集、增生、活化，增強其黏附、吞噬作用，還能促進多種炎性細胞因子的生成。MIF廣泛參與機體多種生理及病理生理學反應，包括炎性反應、腫瘤生成和皮膚創傷修復等。MIF在病毒性心肌炎發病機制中起重要作用。近年來，隨著克隆MIF cDNA的成功及其結構的闡明，MIF的特殊生物功能及其在不同炎癥性疾病中的重要作用已日益為人們所重視。病毒性心肌炎（viral myocarditis，VM）是由親心肌病毒感染所致以心肌炎癥病變為主的疾病，MIF是一種重要的促炎因子，MIF在VMC發病機制及治療中的作用成為目前研究的熱點。因此，本文將MIF的最新進展及其與VM的關系作一綜述。
1 MIF的細胞和組織學來源
MIF既產生于激活的T細胞、單核巨噬細胞及腦垂體前葉，也產生于多種組織細胞，哺乳動物的MIF mRNA和蛋白廣泛表達于各種各樣的造血細胞、中樞和外周神經細胞、具有內分泌和外分泌功能的上皮細胞、脂肪細胞、表皮細胞、汗腺細胞、腎小管上皮細胞、腎小球系膜細胞、血管內皮細胞、角膜上皮細胞及內皮細胞、皮膚角質細胞、肝細胞、肺、前列腺及等[1]。單核巨噬細胞是血液中MIF的主要來源。
2 MIF的膜受體
細胞因子通常需要與其相應的受體結合，活化信號傳導途徑而發揮生理作用。目前大量研究證實MIF激活絲裂原激活蛋白激酶（MAPKs）家族成員之一的細胞外信號調節激酶（ERK1/ERK2）傳導通路，而對其激活方式是受體依賴型還是非受體依賴型的研究也是近年來的熱點。2003年Leng等[2]研究發現，CD74是MIF的可能膜受體。MIF可能通過與細胞膜表面蛋白CD74的細胞外基團結合而發揮作用。CD74為MHCⅡ類相關恒定鏈，是一種跨膜蛋白。MIF與CD74分子的胞外部分即73-232位氨基酸殘基高親和力結合后，激活ERK磷酸化級聯反應，從而引起各種細胞的增生及炎性介質的合成與釋放，產生各種生理效應，而兩種抗CD74抗體（LN2或M-B741）可明顯阻抑MIF的上述作用。CD74胞外部分的可溶性片段sCD7473-232及抗CD74 中和性抗體均可抑制細胞膜上的CD74分子與MIF的結合，從而阻抑MIF的促炎作用。
3 MIF的基因與蛋白結構
人類基因組中MIF定位于21號染色體(21q22，3)，為單拷貝基因。但在小鼠基因組中，則是由10個以上假基因組成的多拷貝基因，定位于10號染色體上。MIF的基因較小，人和小鼠的MIF mRNA長度大約為0.8 kb。1995年，美國Duke大學醫學中心Picower醫學研究所Mitchell等人首次克隆了人MIF基因。人MIF基因全長約2 119 bp，其編碼區由3個外顯子和2個內含子組成，啟動子區域有幾個保守的DNA序列可以和轉錄因子AP1、NF-κB、ETS、GATA、SP1、cAMP結合元件反應蛋白等結合，從而受其調控。在MIF cDNA序列中，第173位堿基G或C的變化構成了MIF的單核苷酸多態性。MIF蛋白結構獨特，為α/β結構，以同源三聚體形式存在，通過單體內的β2片層及α2螺旋C末端之間氫鍵相互作用加以穩定[3]。人和嚙齒類動物MIF蛋白質的一級結構為115位氨基酸殘基，相對分子量為12.5 kD。不同種動物的MIF蛋白質分子的氨基酸序列同源性大于80%，同源性最高的為大鼠和小鼠的MIF蛋白質，僅差1個氨基酸，人和小鼠的同源性也高達90%。人和大鼠的MIF蛋白質三維結構基本相似，差別僅在于C末端的11氨基酸堿基上。
4 MIF的生物學功能
4.1 免疫調節功能：MIF是先天性免疫和獲得性免疫的重要調節因子，是宿主抵抗致病微生物免疫防御系統和應激反應系統中不可缺少的成員。在免疫過程中，MIF不僅有抑制巨噬細胞游走、黏附、吞噬和聚集的功能，還促進其在炎癥局部浸潤、增生、激活及通過調節細胞信號轉導，促進某些細胞因子的表達，分泌細胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ，同時使NO釋放增加和磷脂酶A2的表達增強，產生促炎作用[4~5]；而抗MIF中和性抗體則對過度炎癥反應具有顯著的保護作用；反義MIF可以下調Toll蛋白樣受體4-LPS受體復合物的信號轉導分子，減少Gˉ細菌LPS誘導的TNF-α產生，同時負性調節NF-κB調節的相關細胞因子基因的轉錄。
4.2 對腫瘤的作用：有報道發現肺癌、鼻咽癌、膀胱癌、神經母細胞瘤、前列腺癌、結腸癌、食管鱗狀細胞癌、胃癌以及顱咽管瘤等細胞上有MIF mRNA及蛋白表達，并且多數呈高表達[6]。進一步研究可證實轉移生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor， PDGF）均可上調MIFmRNA及蛋白表達，說明MIF可直接或通過協助其它生長因子而間接地促進腫瘤細胞生長。近期又有發現，抗MIF抗體可有效地抑制腫瘤細胞在淋巴細胞系和血管內皮細胞系中的生長及新血管的形成，從而有效地減慢腫瘤的生長速度。另外，有研究提示，癌細胞的MIF高表達可能影響了腫瘤細胞間的黏附性，使腫瘤細胞更加容易相互分離移動，并向周圍鄰近組織侵襲，從而促進惡性腫瘤的浸潤轉移。目前，關于MIF促進腫瘤發生發展的機制還不清楚，有研究認為MIF對抑癌基因P53的抑制作用可能與其致癌作用有關[7，8]。另外，MIF也可以通過促進基質金屬蛋白酶MMP-9的表達增加，從而促進癌細胞向淋巴結的轉移。
4.3 神經內分泌功能：MIF作為垂體激素和糖皮質激素的一種負反饋調節劑。某些促甲狀腺素垂體細胞通過下丘腦-垂體-腎上腺軸起始宿主應答時伴有MIF的釋放，在下丘腦切除的裸鼠里注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）后發現垂體細胞釋放MIF的量與血清中MIF的量基本接近。在下丘腦-垂體-腎上腺軸受刺激后，垂體以“激素樣”方式分泌MIF。MIF可能是一種對糖皮質激素起負調節作用的細胞因子。
4.4 酶學功能：MIF能催化互變異構反應和氧化還原反應，具有3種催化活性作用[9]：為多巴色素異構酶；羥苯丙酮酸互變異構酶，能催化羥苯丙酮和羥苯丙酮酸的酮基-烯酸的互變異構；谷光甘肽（GSH）和二羥酯酰胺作為MIF生理性氧化還原底物，并且它還作為一種新型蛋白質-巰基氧化還原酶參與氧化還原反應。但MIF明確的生理和病理生理功能與催化特性間的關系并未確定。
4.5 損傷修復功能：有研究發現在角膜損傷的愈合過程中，伴隨著角膜細胞浸潤和內皮細胞的分化，MIFmRNA的表達水平也相應增加。隨后發現，在小鼠皮膚損傷愈合過程中，MIF表達有增加趨勢，而應用抗MIF抗體可推遲損傷的愈合。近期Mitchell 等發現內源性、外源性MIF均可刺激NIH/3T3成纖維細胞的增殖，MIF的這種促增殖效應與P44/P42有絲分裂原激活的蛋白激酶的活性有關。此外，他們還發現MIF可通過蛋白激酶A來調節胞質中磷脂酶的活性；而外源性增加的rMIF還可逆轉糖皮質激素對胞質中磷脂酶A2的抑制作用，
5 MIF與VM
VM是臨床較常見的疾病之一，患病率達21.83/10萬，且年齡越小，發病率越高。病毒感染后所致的心臟炎癥可累及心肌細胞、間質組織、血管成分及心包，而導致急性、亞急性和慢性病變。VM急性期可引起心衰、心律失常等癥狀，極少數患者因嚴重心律失常、心力衰竭和心源性休克而死亡。部分患者由于急性期后炎癥持續，轉為慢性心肌炎，出現進行性心臟擴大、心功能減退、頑固性心律失常，經過數年或更長時間后死于并發癥。引起VM的病原體有20余種，但最常見的為柯薩奇病毒B組（coxsackievirus B，CVB），有50%以上的VM與之有關，其次為腺病毒（adenovirus，ADV）。VM的發病機制至今尚未完全闡明，目前多數認為是病毒直接損害和免疫變態反應所致。目前臨床上VM常采用支持治療、中藥、抗心力衰竭和抗病毒藥物、免疫抑制劑等治療方法，但療效欠佳，部分預后不良[10]。因此，深入研究該病的發病機制，闡明其病理生理過程，尋找有效的藥物治療和生物治療靶點，成為國內外學者研究的熱點和難點。
近年來VM發病率呈增長趨勢，現已知CVB是VM的主要病原，并認為CVB誘導的心肌炎可能在感染過程中依賴細胞因子的釋放，細胞因子在VM發病機制中占有主導地位。MIF是新發現的一種多效型細胞因子，是一種重要的前炎癥因子，由單核巨噬細胞、激活的T細胞、角質細胞等產生，其主要作用為抑制巨噬細胞的游走移動，促進巨噬細胞在炎癥局部浸潤、聚集、增生、活化，增強其黏附、吞噬作用，此外，還能促進IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等多種細胞因子的生成，從而間接增強巨噬細胞的功能，參與機體炎性反應和免疫應答。最近，MIF在心肌炎中的作用受到廣泛關注。Matsui等[11]在實驗性自身免疫性心肌炎中發現，心肌組織MIF mRNA和蛋白水平明顯增加，此外，血清MIF濃度也顯著升高，而通過MIF中和抗體阻斷MIF的表達則可以明顯減輕心肌的病變程度，以及降低心肌中VCAM-1（血管細胞間黏附分子）、IL-1β、TNF-α的表達。同樣，Shioji等[12]在研究自身免疫性巨細胞性心肌炎時發現，當注射MIF中和抗體后，心肌炎癥病變也顯著減輕。郭富強等[13]的研究亦發現，MIF在柯薩奇病毒性心肌炎小鼠心肌表達上調，與心肌損害程度密切相關。張小佛等[14]報道急性VM患兒血清MIF水平明顯升高，并與CK-MB呈正相關。這些研究提示，MIF可能與VM的形成有密切關系，有望成為治療和預防VM的一種關鍵靶分子。
6 展望
MIF作為機體的一種多效性的細胞因子，在炎癥應答、免疫調節、神經內分泌和細胞增殖中發揮作用，近年來其在VM發生中的致病作用倍受人們關注。盡管目前對其致病機制還不完全清楚，但MIF的中和抗體已經在動物實驗和臨床上取得較好的療效，另外，其他拮抗MIF的藥物也相繼被發現，如維生素E和西替利嗪等。因此，隨著研究的深入，針對MIF的干預治療將為臨床治療VM提供一個新的思路和方法。
參考文獻：
[1] Metz CN，Bucala R.Cytokine Ref [M].San Diego:Academic Press，2000.703.
[2] Leng L，Metz CN，Fang Y，et al. MIF signal transduction initiated by binding to CD74[J]. J Exp Med，2003，197(11):1467.
[3] Swope MD，Sun HW，Klockow B， et al.Macrophage migration in-hibitory factor interactions with glutathione and 5-Hexylgluthione[J]. J Biol Chem，1998，273(24):14877.
[4] Abe R，Peng T，Sailor S，et al.Regulation of the CTL response by macrophage migration inhibitory factor[J].J Immunol，2001，166(2):747.
[5] Aeberli D，Leech M，Morand EF. Macrophage migration inhibitory factor and glucocorticoid sensitivity[J].Rheumatology，2006，45(8): 937.
[6] 卞麗娟，李 智.巨噬細胞移動抑制因子與腫瘤[J].國際腫瘤學雜志，2006，33(9):661.
[7] Sun B，Nishihira J，Yoshiki T，et al.Macrophage migration inhibitory factor promotes tumor invasion and metastasis viaRho-dependent pathway[J]. Clin Cancer Res，2005，11(3):1050.
[8] Fingerle RG，Petrenko O，Metz CN，et al. The p53-dependent effects of macrophage migration inhibitory factor revealed by gene targeting[J]. Proc Natl Acad Sci Usa，2003，100(16):9354.
[9] Pennock JL，Wipasa K，Gordge MP，et al.Interaction of macrophage migration inhibitory factor with haematin [J].J Biol Chem， 1998， 273(2)：905.
[10] Magnani JW，Dec GW. Myocarditis:current trends in diagnosis and treatment[J].Circulation，2006，113(6):876.
[11] Matsui Y，Okamoto H，Jia N，et al.Blockade of macrophage migra-tion inhibitory factor ameliorates experimental autoimmune my-ocarditis[J]. J Mol Cell Cardiol，2004，37(2):557.
[12] Shioji K，Kishimoto C，Sasayama S. Fc receptor-mediated inhibitoryeffect of immunoglobulin therapy on autoimmune giant cell my-ocarditis: concomitant suppression of the expression of dendritic cells[J]. Circ Res，2001，89(7):540.
[13] 郭富強，于小華，李雙杰，等. 巨噬細胞移動抑制因子在病毒性心肌炎小鼠心肌中表達[J].臨床兒科雜志，2007，25(10):818.
最初發現MIF在先天性免疫和獲得性免疫過程中起重要作用。既能活化淋巴細胞、粒細胞及巨噬細胞，又能抑制糖皮質激素的生理作用，從而調節免疫系統功能。進一步研究發現抑制MIF可改善自身免疫性疾病大鼠模型的病情進展；此外，值得注意的是MIF在多種腫瘤細胞中高表達，這使得MIF極可能成為治療自身免疫病及腫瘤的新靶點。很多研究表明MIF與急性胰腺炎、炎性腸病、川崎病、哮喘、膿毒癥等炎癥性疾病及胃癌、肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤密切相關，本文將對其分子機制做一綜述。
1MIF在細胞中的分子作用機制
MIF由115個氨基酸構成，分子量為12.5kd，二級結構與主要組織相容性抗原（MHC）高度相似，由兩個反向平行的α螺旋和六個β折疊構成。MIF的活性形式是由三個同源單體構成的三聚體與D-多巴色素互變異構酶高度同源。這種獨特的三級結構使其具有異構酶活性，它的羧基末端是其酶學活性的關鍵并能穩定其三級結構[1]。已合成多種MIF抑制劑，ISO-1抑制MIF互變異構酶活性及其細胞因子活性，抑制內毒素大鼠巨噬細胞TNF的釋放，降低其死亡率；Mitchell等[2]合成了一種效用強于ISO-1的小分子量MIF抑制劑4-IPP，能不可逆性抑制MIF異構酶活性，尤其是在癌癥組織中。
最初認為MIF由T淋巴細胞分泌作用于巨噬細胞，然而接下來的研究發現巨噬細胞、B淋巴細胞、粒細胞等大多數炎性細胞均表達MIF，并在宿主防御反應中起關鍵作用。大多數上皮細胞表達并儲存MIF，鑒于上皮細胞是阻擋病原體的第一道屏障，MIF的存在提示其在早期固有免疫中起重要作用。有趣的是MIF在腺垂體中被檢測到，特別是在分泌ACTH的細胞內，在此MIF的分泌遵循晝夜節律，并與皮質類固醇的分泌峰值相一致。從在不同組織細胞中的分布情況看，MIF很可能不僅在機體免疫防御方面起重要作用，還有其他生理功能未被闡明。
盡管MIF在多種免疫細胞中的作用已經知曉，但科學家花了很長時間研究它所參與的信號傳導途徑。試驗表明MIF信號傳導途徑的受體CD74為一種II型跨膜蛋白，在巨噬細胞CD74與MIF結合具有高度親和力，這種復合物介導胞外MAPK活性及細胞增殖。此外CD44作為MIF的復合跨膜受體協同引發ERK1和ERK2激酶磷酸化，MIF與CD74和CD44受體絲氨酸磷酸化有關，進一步能夠抑制細胞凋亡[3]。Bernhagen J等[4]研究認為MIF競爭性結合功能性受體CXCR4和CXCR2，形成CXCR2-CD74-MIF復合物誘發單核細胞聚集于動脈粥樣硬化炎性病變處，可實測到快速整合蛋白及鈣離子內流。而MIF缺陷大鼠動脈粥樣硬化模型可見單核細胞聚集明顯減少。作者認為MIF具有趨化因子樣功能調節炎性細胞募集。MIF與受體結合后，發生細胞內ERK-MAP信號通路級聯反應，通過細胞周期蛋白D1轉錄和Rb基因磷酸化促進細胞增殖。在此快速短暫級聯反應中還有另外一條通路，MIF與蛋白Jab-1/CSN5在胞內結合，絲氨酸激酶起重要作用并加快細胞周期[5]。
2MIF與炎癥
MIF最初被發現于研究IV型遲發型免疫反應的細胞上清液中。結核菌素注射引發的炎性細胞浸潤的巨噬細胞亦產生MIF，與對照組比較MIF抗體明顯減輕過敏反應及炎性細胞浸潤。因此，MIF被認為是一種促炎性細胞因子。這種觀點進一步在感染性休克大鼠模型上得到證實，注射內毒素之后MIF的分泌及蛋白合成明顯增加，然而加入重組MIF后這種效應被減弱。利用反義MIF可抑制MIF及TNF α等細胞因子的產生，這表明MIF具有自分泌功能以抑制類固醇效應及部分細胞因子的生成[6]。在多種炎性組織中均檢測出MIF分泌增多，然而破壞MIF功能能否減輕炎癥反應及疾病預后，各項研究成果有所沖突。
Bacher 等報道MIF能夠影響T細胞的增殖與活性。隨后發現巨噬細胞不僅是MIF的效應細胞也是MIF的分泌細胞，而MIF增強TNF及IFN的表達，這種自分泌的形式加快了細菌自感染病灶的遷移，并且能夠減少中性粒細胞的凋亡[6]。Roger等[6]一系列實驗研究表明MIF作用于巨噬細胞及單核細胞的TLR-4（Toll-like receptor 4），后者則是內毒素受體。MIF基因敲除大鼠僅低表達這種受體，這或許能夠解釋內毒素對這種大鼠相對較低的致死率。
當機體處于“應急”或免疫反應時，腎上腺釋放糖皮質激素，后者可以削弱Th1及單核巨噬細胞的活化，抑制促炎細胞因子的釋放和PLA2的合成，減輕炎癥反應。另一方面，腺垂體和單核巨噬細胞又合成大量的MIF，MIF又可促使巨噬細胞釋放大量細胞因子，兩者的分泌可相互促進。這提示MIF和下丘腦垂體腎上腺軸有直接的因果關系，具有拮抗糖皮質激素的抗炎作用。這種相互拮抗作用提示有某種潛在機制避免炎癥反應過度化[7]。Attila Paszt等應用糖皮質激素及其拮抗劑干預AP大鼠模型示MIF是急性胰腺炎發病過程中的一個關鍵性炎癥因子，糖皮質激素在其導致的多器官損害中發揮重要作用[8]。
多項研究表明MIF在特應性皮炎、哮喘、銀屑病、潰瘍性結腸炎、風濕性關節炎等多種炎性疾病中高表達。Otukesh等[9]對小兒尿路感染的臨床研究顯示MIF可作為鑒別膀胱炎與腎盂腎炎的一項重要指標，并且是永久性腎損害的危險因素。Santos等[10]研究認為MIF作為一種多效性促炎性細胞因子在風濕性關節炎具有多個細胞靶點，通過MAP激酶及ERK激酶信號通路活化T細胞，促進特異性免疫反應，與風濕性關節炎的嚴重程度密切相關。J.Wu等[11]研究認為MIF具有多態現象，因基因啟動子在不同炎性疾病中表達不同，并證實MIF-173G/C與小兒哮喘密切相關。在DSS誘導的潰瘍性結腸炎大鼠中MIP-1及MCP-1表達顯著增加，活體研究發現MIF調節MIP-1及MCP-1的表達，MIF缺陷大鼠炎性改變明顯減輕，揭示MIF在自身免疫性腸病的發病起關鍵作用[12]。
3MIF與腫瘤
目前認為，MIF作為一種獨特的細胞分泌因子，不僅可以參與調節炎癥反應以及機體免疫調節反應，而且MIF 還在多種腫瘤細胞，癌前病變中都過表達，從而促進腫瘤的發生和發展[13]，和細胞增殖、細胞分化及腫瘤血管生成等關鍵環節密切相關[14]。
有研究證明，靶向沉默MIF基因后，肺腺癌A549細胞的侵襲與遷移能力下降90%，若MIF過表達，則可觀察到相反現象[14]。MIF參與了肺癌特別是非小細胞肺癌(NSCLC)的發生和發展，研究表明：NSCLC 肺癌組織標本高表達MIF與血中血管內皮生長因子(VEGF) 和肺癌組織CXC趨化因子表達升高呈正相關，特別是與腫瘤組織微血管密度呈顯著正相關。McClelland等[15]進一步發現，NSCLC組織標本異的MIF受體－CD74 表達同樣顯著增高且誘導體內外促血管新生的CXC趨化因子表達升高；MIF 這種誘導血管新生效應可被CD74 抗體所拮抗；侯俊娜等[16]研究表明：大細胞肺癌H460 細胞株高表達MIF蛋白，體外應用siRNA 靶向沉默MIF基因后，H460 細胞的活性、增殖能力下降; 繼而用AnnexinV-FITC / PI 雙染色凋亡檢測發現，轉染MIF siRNA 部分阻斷MIF 表達后，H460 細胞凋亡率顯著增加。上述結果均提示MIF 與NSCLC血管生成和腫瘤細胞轉移有密切關系。大量研究表明，MIF 通過抑制抑癌基因p53 的功能、持續激活胞外信號調節激酶(ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路、誘導環氧化酶(COX)/前列腺素E2(PGE2) 激活、促進血管內皮細胞的增殖及分化等獨特的生物學作用多層次促進腫瘤的生長、增殖及侵襲[17]，并且在低分化腫瘤中，MIF表達與預后相關。Jung等[18]研究表明，MIF 阻止P53 從胞漿轉移至胞核，并且可抑制P53 的活性，抑制細胞增殖、促進凋亡。Binsky等[19]在慢性淋巴細胞白血病的研究中發現，MIF表達明顯升高，通過激活IL -8，繼而Bcl-2表達增加，抑制腫瘤細胞凋亡，促進細胞增殖。Arenberg等[20]發現，在C57BL /6 小鼠肺損傷急性期，MIF表達增加，抑制在急性期注入小鼠體內的Louis 癌細胞的凋亡，促進其增殖，而在敲除MIF基因的小鼠中則無此現象。
最新研究報道，在單核細胞，巨噬細胞中發現高爾基體蛋白p115和MIF都有表達，且在細胞質中p115能夠調節MIF的分泌。在炎癥刺激下，單核細胞中p115 能從高爾基體上移位到細胞質其他部位，游離的p115 可與細胞質中的MIF因子結合，可將MIF 轉運到細胞膜上與其特異的CD74，CD44受體結合；也可刺激MIF 的分泌，使得上清液中的p115和MIF含量增加。p115 的這種位置變化可以產生一系列的級聯反應，從而引起細胞內的信號傳導。在前列腺癌中免疫共沉淀結果也顯示高爾基體上的蛋白p115的羧基末端與MIF相連[21]，這表明前列腺癌細胞中p115 和MIF相關。Bucala[22]提出MIF的調節是受體為基礎的信號轉導通路, 可與靶細胞表面受體相互作用，CD74 是細胞膜上MIF的高親和力結合蛋白, 分布在細胞質和胞膜上, 但是MIF不能與胞質中的CD74結合, 只能與胞膜及膜外區域的CD74受體結合，且CD74 是一種II 型跨膜蛋白, 可啟動向ERK /MAPK 激酶傳導依賴的M IF信號, 有研究報道MIF能短暫也可持續地激活ERK信號通路, 與細胞增殖, 分化相關[23]。MIF結合到CD74-CD44復合體, 導致CD74-ICD釋放, 通過Sky和Akt激活NF-B, 促進B細胞DNA合成, 進入S期, 細胞分裂, Bcl-XL 和Bcl-2轉錄增加, 細胞存活。何興祥等[24]實驗表明靶向MIF的siRNA可以促進大腸癌細胞的凋亡, 可能的機制是MIF siRNA抑制MIF的表達, 導致CD74 的表達下降, Caspases8和Caspases3表達增加誘導凋亡增加。易永芬等[25]研究指出胃癌及肝癌中P115和MIF的表達呈正相關, P115在腫瘤中表達的增加影響MIF的表達和分泌, 改變其在細胞內空間位置, 使得MIF能夠與細胞膜及胞外的CD74受體結合,活化MAPK途徑, 導致腫瘤的發生。
綜上所述，MIF在炎癥性疾病、自身免疫性疾病及腫瘤的發生發展過程中起重要作用，有望成為疾病早期診斷預測疾病進展和治療預后的生物靶標。一些小分子MIF抑制劑已被合成并進入臨床試驗階段。
參考文獻
[1]El-Turk F, Cascella M, Lashuel HA ,et al.The conformational flexibility of the carboxy terminal residues 105-114 is a key modulator of the catalytic activity and stability of macrophage migration inhibitory factor[J]. Biochemistry ,2008,47: 1074010756.
[2]Winner M, Meier J, Mitchell R A, et al. A novel, macrophage migration inhibitory factor suicide substrate inhibits motility and growth of lung cancer cells[J]. Cancer Res., 2008,68:72537257.
[3]Shi X, Leng L, Bucala R, et al. CD44 is the signaling component of the macrophage migration inhibitory factor-CD74 receptor complex[J]. Immunity 2006, 25: 595606.
[4]Bernhagen J, Krohn R, Weber C, et al. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment[J]. Nat Med 2007, 13: 587596.
[5]Lue H, Kapurniotu A, Bernhagen J, et al. Rapid and transient activation of the ERK MAPK signalling pathway by macrophage migration inhibitory factor (MIF) and dependence on JAB1/CSN5 and Src kinase activity[J]. Cell Signal, 2006, 18:688703.
[6]Roger T, Chanson AL, Knaup-Reymond M,Calandra T: Macrophage migration inhibitory factor promotes innate immune responses by suppressing glucocorticoid-induced expression of mitogen-activated protein kinase phosphatase-1[J]. Eur J Immunol,2005, 35: 34053413.
[7]Bucala R, Donnelly SC: Macrophage migration inhibitory factor: a probable link between inflammation and cancer[J]. Immunity, 2007, 26: 281285.
[8]Attila Paszt,Szabolcs A,Katalin Eder, et al. Effects of glucocorticoid agonist and antagonist on the pathogenesis of L-arginine-induced acute pancreatitis in rat[J]. Pancreas, 2008 ,36(4):369-76.
[9]Hasan O, Rozita H, Sepideh H , et al. Urine macrophage migration inhibitory factor in children with urinary tract infection: a possible predictor of acute pyelonephritis[J]. Pediatr Nephrol ,2009,24:105-111
[10]Santos LL, Dacumos A,Yamana J, et al. Reduced arthritis in MIF deficient mice is associated with reduced T cell activation: down-regulation of ERK MAP kinase phosphorylation[J].Clinical and Experimental Immunology ,2008, 152: 372-380
[11]Wu J, Fu S, Ren X, Jin Y, et al. Association of MIF promoter polymorphisms with childhood asthma in a northeastern Chinese population[J]. Tissue Antigens,2009,73: 302306
[12]Ohkawara T, Mitsuyama K, Takeda H, et al. Lack of macrophage migration inhibitory factor suppresses innate immune response in murine dexran sulfate sodiuminduced colitis[J]. Scand J Gastroenterol ,2008, 43: 1497-504.
[13]Verjans E,Noetzel E,Bernhagen J,et al. Dual role of macrophage migration inhibitory factor in human breast cancer[J]. BMC Cancer,2009,9 (14) :230.
[14]Rendon BE,Roger T,Teneng I,et al. Regulation of human lung adenocarcinoma cell migration and invasion by macrophage migration inhibitory factor[J]. Biol Chem,2007, 282( 41) : 29910-29918.
[15]McClelland M,Zhao L,Carskadon S, et al. Expression of CD74, the receptor for macrophage migration inhibitory factor, in non-small cell lung cancer[J]. Am J Pathol,2009, 174(2);638-646.
[16]侯俊娜，羅益鋒，王杜娟，楊惠玲，郭禹標。siRNA 沉默MIF基因抑制大細胞肺癌H460細胞增殖[J]。中國病理生理雜志，2011，27(5) : 853－858
[17]Conroy H,Mawhinney L,Donnelly SC.Inflammation and cancer: macrophage migration inhibitory factor-the potential missing link[J]. QJM,2010, 103(11): 831- 836.
[18]Jung H,Seong HA,Ha H. Critical role of cysteine residue 81 of macrophage migration inhibitory factor in MIF-induced inhibition of p53 activity[J].Biol Chem,2008,283(29) :20383-20396.
[19]Binsky I,Haran M,Starlets D ,et al. IL-8 secreted in a macrophage migration-inhibitory factor-and CD74- dependent manner regulates B cell chronic lymphocytic leukemia survival[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2007,104 (33):13408-13413.
[20]Arenberg D,Luckhardt TR,Carskadon S, et al. Macrophage migration inhibitory factor promotes tumor growth in the context of lung injury and repair[J]. Am J Respir Crit Care Med,2010,182(8):1030-1037.
[21]Barrilleaux BL,Fischer-Valuck B W,Gilliam JK, et al. Activation of CD74 inhibits migration of human mesenchymal stem cells[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim,2010,46（6）:566-572.
[22]Bucala R. Signal transduction. Amost interesting factor [ J] . Nature,2000, 408(6809): 146 - 147.
[23]Veillat V, CarliC, Metz CN, et al. Macrophage migration inhibitory factor elicits an angiogenic phenotype in human ectopic endometrial cells and triggers the production of major angiogenic factors via CD44, CD74, and MAPK signaling pathways[J].JC lin Endocrinol Metab, 2010, 95(12) : E 403 - 12.
學意義; 甘露糖不能誘導Mφ分泌TNFα與IL4。結論: RTP引起的Mφ分泌TNFα作用是通過甘露糖受體介導， 而APS的作用不僅僅與甘露糖受體有關。兩種多糖與甘露糖受體的作用差異可能與其單糖組成密切相關。
【關鍵詞】 巨噬細胞 甘露糖受體 大黃多糖 當歸多糖 腫瘤壞死因子 白細胞介素4
許多中藥多糖能夠刺激巨噬細胞（Macrophage， Mφ）釋放前炎癥因子或者某些細胞因子， 推測其可能機制與Mφ膜上的模式識別受體（pathogen recognition， PRR）結合引起細胞內某些信號通路的活化有關。前期研究發現， 當歸多糖（Angelica sinensis Diel polysaccharide， APS）能夠促進樹突狀細胞的成熟， 增強抗原提呈能力［1， 2］; 促進脾細胞IL2、 IFNγ的分泌［3］; 而RTP（Rheum tanguticum polysaccharide， RTP）能夠對抗結腸炎大鼠CD4+T細胞的擴增， 降低克隆氏病大鼠IFNγ的升高， 升高結腸炎小鼠降低的IL4水平［4， 5］。但是RTP和APS的免疫反應作用機制， 尚不清楚。
Mφ是體內特定的吞噬細胞和抗原提呈細胞， 是連接先天免疫系統及后天免疫系統的橋梁。其表面眾多膜受體參與完成這些功能， Mφ甘露糖受體(Macrophage Mannose receptor， MMR)為其中之一。研究表明， MR是一種PRR， 可特異性地識別以甘露糖、 N乙酰葡糖胺或巖藻糖為末
端的配體并與之結合［6］， 這些配體可來源于內源性或外源性分子。推測MR在病原體的識別、 吞噬與清除， 在結核、 腫瘤、 感染等許多疾病過程中都發揮著重要的作用。我們的研究表明， RTP含有近50%的甘露糖［7］， 組分RTP1， RTP2所含單糖比例不同; APS則含有N乙酰
葡糖胺殘基［1］， 組分APS1， APS2， APS3所含單糖比例也不同。這兩種多糖的免疫調節作用可能是通過MMR而起效的。本研究將探討APS混合組分、 RTP混合組分對Mφ吞噬及分泌細胞因子的影響， 以揭示兩種中藥多糖的免疫調節作用。
1 材料和方法
1.1 材料
SD大鼠（200～220 g， 雌雄各半）， 由第四軍醫大學動物實驗中心提供， 動物分籠飼養于空調溫室內， 溫度22±2℃， 相對濕度50%～60%， 自動調控晝夜各12 h， 顆粒飼料喂養， 自由飲水。RPMI1640培養基購自Gibco公司， 胎牛血清購自杭州四季青公司生物制品廠， PBS緩沖液購自博士德生物工程公司， 甘露糖購自上海試劑二廠; 半乳糖購自國藥集團化學試劑有限公司; APS及RTP由我實驗室提供， EDTA以及異硫氰酸熒光素標記的甘露糖化牛血清白蛋白(ManFITCBSA) 購自Sigma公司; GENios pro多功能酶標儀為瑞士TENCN公司產品; Nikon H600L熒光顯微鏡為日本Nikon公司產品。
1.2 方法
1.2.1 腹腔Mφ的分離、 純化及培養
取6只雌性SD大鼠， 乙醚麻醉， 750 mL/L乙醇浸泡1 min， 取出， 消毒腹部皮膚， 打開腹壁， 但勿傷及腹膜。用注射器向腹腔內注入PBS 10 mL， 輕揉腹腔5 min， 剪開腹膜， 用吸管吸取腹腔內液體， 注入離心管， 1 000 r/min 離心5 min。棄上清， 分別加入6 mL含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養液， 吹打混勻后計數， 調整細胞密度為1×109個/L， 分別接種腹腔Mφ于對應的培養板中， 置37℃ 50 mL/L CO2孵箱中培養。3 h后輕輕吸棄培養液后， 再用PBS洗去未貼壁細胞， 重復3次， 每孔加入含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養液， 用姬姆薩瑞氏染色法染色， 觀察Mφ占 95％以上［8］。純化后的單層大鼠腹腔Mφ用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培養液置于37℃ 50
mL/L CO2孵箱中培養。
1.2.2 熒光顯微鏡觀察MFITCBSA與Mφ的結合能力
取純化腹腔Mφ， 以每孔1×106個腹腔Mφ接種于底部覆蓋玻片的6孔培養板， 純化后分為3組: 空白對照組（2 mL 500 mL/L RPMI1640/PBS緩沖液）; ManFITCBSA陽性對照組（2 mL 0.01 g/L ManFITCBSA）; 甘露糖加MFITCBSA實驗組（1 mL 1 g/L Man+1 mL 0.01 g/L ManFITCBSA）。用錫鉑紙包嚴培養板， 置37℃ 50 mL/L CO2孵箱中避光孵育60 min; 用PBS沖洗接種有Mφ的蓋玻片3遍， 40 g/L多聚甲醛固定30 min， PBS洗片， 晾干后滴上500 mL/L的甘油PBS 10 μL， 石蠟封片， 4℃短時儲存留待觀察。熒光顯微鏡激發光譜495 nm， BA520阻擋濾光片， DM505二向分色濾光片。
1.2.3 多糖對Mφ吞噬ManFITCBSA的影響
取純化腹腔Mφ， 以每孔1×104個接種于Costar96孔底部透明板， 置37℃及4℃， 50 mL/L CO2孵箱中孵育4 h， PBS沖洗3遍， 分別加入不同濃度的甘露糖（Man）、 半乳糖(GaL)、 APS混合組分、 RTP混合組分以及ManFITCBSA， 每組3個孔各加100 μL， 置37℃及4℃， 50 mL/L CO2孵箱中避光孵育60 min后， 棄上清， PBS沖洗3遍， 重復3次［9］。
1.2.4 多糖對Mφ分泌細胞因子的影響
取純化Mφ， 以每孔1×104個腹腔Mφ接種于Costar96孔培養板， 分別與APS、 RTP、 Man、 APS+ Man
、 RTP+ Man在37℃， 50 mL/L CO2孵箱中培養36 h， 取細胞上清按照試劑盒說明（Rat IL4 ELISA Kit， Rat TNFα ELISA Kit， BOSTER）測定細胞因子水平。簡述如下: 在酶標板加入100 μL不同濃度的標準品， 繪制標準曲線， 在反應孔中加入待測樣品的Mφ培養液上清各100
μL， 然后加入100 μL生物素標記抗體， 37℃反應1 h， 0.01 mol/L PBS洗板3次， 然后每孔加入100 μL親和素過氧化物酶復合物（ABC）， 37℃反應30 min， 洗板5次， 加入TMB顯色液， 避光反應10～25 min， 加入TMB中止液， 450 nm測定光吸收值。
1.2.5 統計學處理
數據以x±s表示， 利用SPSS11.0軟件進行分析， 顯著性檢驗采用t檢驗及SNKq檢驗， P
2 結果
2.1 甘露糖抑制Mφ吞噬ManFITCBSA 采用熒光顯微鏡觀察腹腔Mφ吞噬ManFITCBSA的情況(圖1A)， 通過競爭抑制試驗觀察到: D甘露糖可以抑制該現象(圖1B)。
2.2 多糖對Mφ吞噬功能的影響
采用多功能酶標儀檢測Mφ吞噬ManFITCBSA的能力， 實驗結果表明: 在37℃時， Mφ吞噬活性與ManFITCBSA濃度呈正相關， 在4℃時， ManFITCBSA與Mφ為非特異性吸附， 熒光強度不隨ManFITCBSA濃度改變而發生變化（圖2）; ManFITCBSA與MMR的結合為Ca2+依賴性， EDTA可阻斷該過程（圖3）， 其阻斷能力與EDTA濃度呈正
相關; 甘露糖作為MR的阻斷劑， 也阻斷該過程， 其拮抗能力與甘露糖濃度相關， 半乳糖則不能阻斷MR介導的Mφ對ManFITCBSA的吞噬作用（圖4）; APS、 RTP均可阻滯Mφ吞噬ManFITCBSA的作用， 且呈劑量依賴性(圖5、 6)。
2.3 多糖刺激Mφ釋放TNFα， IL4的測定
采用ELISA法檢測細胞培養液中TNFα和IL4水平， 體外將APS和RTP與Mφ共孵育36 h， 可以促進正常腹腔Mφ分泌TNFα(圖6)， 與正常對照組相比有統計學意義（P
3 討論
我們已發現， RTP與APS均具有免疫調節作用， 但它的免疫調節機制目前尚不清楚。本實驗證明RTP、 APS均可抑制Mφ吞噬ManFITCBSA，提示RTP、 APS的免疫調節作用可能通過MR介導。
許多中藥多糖富含甘露糖或葡萄糖， 且以反復串聯的結構存在， 與MR具有比MRmAb更高的結合特性［10］。如殼寡糖可通過Mφ表面的MR， 產生白介素1β和TNFα［11］; 海帶多糖能激活小鼠腹腔Mφ， 對S180腫瘤細胞有較好的殺傷作用［12］。我們的研究表明RTP含有近50%的甘露糖， 而APS則含有N乙酰葡糖胺殘基， 因此， RTP、 APS具有潛在的MR結合特性。我們的實驗結果表明， RTP與APS均可以阻斷MR介導的Mφ吞噬作用， 且這種作用呈現劑量依賴關系， 為兩種多糖作用于MR提供了依據。
為了進一步研究兩種多糖與MR的作用， 我們發現RTP和APS均可以促進Mφ分泌細胞因子TNFα， 而MR的拮抗劑甘露糖可完全阻斷RTP刺激Mφ分泌TNFα的作用， 說明RTP是通過MR而起作用; 甘露糖則沒有該作用; RTP和APS對Mφ分泌細胞因子IL4無明顯影響， 揭示RTP和APS影響Mφ的免疫功能主要通過Th1型細胞免疫發揮作用， 同時提示我們以前實驗中RTP和APS影響T細胞極化可能通過MR起作用。
參考文獻
［1］Cao W， Liu L， Mei Q， et al. Structural analysis of watersoluble glucans from the root of Angelica sinensis (Oliv.) Diels［J］. Carbohydr Res， 2006， 341(11): 1870-1877.
［2］張 蓉， 劉 莉， 梅其炳， 等. 成人外周血來源的樹突狀細胞的體外誘導［J］. 實用醫學雜志， 2005， 21（13）: 1381-1383.
［3］Schepetkin IA， Quinn MT. Botanical polysaccharides: macrophage immunomodulation and therapeutic potential［J］. Int Immunopharmacol， 2006， 6(3): 317-333.
［4］楊鐵虹， 梅其炳， 周四元. APS組分APS3對不同淋巴細胞亞群的作用［J］. 中國生化藥物雜志， 2005， 26(6): 344-346.
［5］Liu L， Wang ZP， Mei QB， et al. Effects of Rheum tanguticum polysaccharide on TNBS induced colitis and CD4+T cells in rats［J］. World J Gastroenterol， 2003， 9(10): 2284-2288.
［6］Linehan SA， MartinezPomares L， Stahl PD， et al. Mannose receptor and its putative ligands in normal murine Lymphoid and nonlympoid organs［J］. J Exp Med， 1999， 189(12): 1961-1972.
［7］趙 燕， 劉 莉， 張生勇， 等. 中藥RTP中單糖組成的毛細管區帶電泳分析［J］. 分析化學， 2006， 34(2): 255-258.
［8］王 健， 冷 靜， 王啟輝. LPSp輔佐 HBsAg誘導機體產生特異性抗體的機制［J］. 細胞與分子免疫學雜志， 2007， 23(6): 559-561.
［9］MartinezPomares L， Reid DM， Brown GD， et al. Analysis of mannose receptor regulation by IL4， IL10， and proteolytic processing using novel monoclonal antibodies［J］. J Leukoc Biol， 2003， 73(5): 604-613.
［10］Schepetkin IA， Quinn MT. Botanical polysaccharides: macrophage immunomodulation and therapeutic potential［J］. Int Immunopharmacol， 2006， 6(3): 317-333.
關鍵詞：KLF4；基因轉染；R8w264.7細胞；C2C12細胞；細胞增殖
中圖分類號：R361 文獻標識碼：A 文章編號：1007－7847(2007)03－0263－05
Kruppel樣因子4(Kruppel-1ike factor4，KLF4)是Sp/Kdlppel樣鋅指轉錄因子家族的成員之一，這個家族目前已發現20多個成員，如Spl-4、KLPl-14等，Sp/Kruppel樣因子是機體內一類具有重要功能的蛋白質，它們參與調控細胞增殖、分化、胚胎發育等重要生命過程，并與腫瘤等多種疾病有關，研究表明，KLF4在胚胎發育晚期及腸管分化終末期的上皮細胞中其表達均增高，提示KLF4具有抑制某些細胞增殖的功能，為了深入探討KLF4的功能，本研究室建立了穩定高表達該基因的Raw264.7小鼠巨噬細胞株和C2C12小鼠肌原細胞株，在此建株過程中，我們發現轉染KLF4對上述兩種細胞增殖的影響明顯不同。
1 材料和方法
1．1 材料
Raw264.7巨噬細胞株購自上海細胞中心；C2Cn小鼠肌原細胞由本校細胞中心提供：DMEM及RPMI-1640培養基購自Gibeo公司；G418購自Promega；無支原體小牛血清，杭州四季青生物工程公司產：丙烯酰胺、N，N′2亞甲基雙丙烯酰胺購自Fluka公司；二硫蘇糖醇(DTT)、過硫酸胺、TEMED、硝酸纖維素膜購自Promega公司；Lipo-feetamineTM 2000、真核表達載體質粒pcDNA3.1購自Invitrogen life technologies公司：peDNA3.1-KLF4重組質粒本室構建；兔抗KLF4多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG及DAB顯色試劑盒購自博士德生物工程有限公司：CCK-8溶液由日本同仁化學株式會社提供。
1．2 方法
1．2．1 KLF4過表達細胞株的建立
利用脂質體介導的轉染技術(根據Invitrogenlife technologies公司提供的轉染操作說明書進行操作)將空載體pcDNA3.1和重組質粒pcDNA3.1-KLF4導人Raw264.7和C2C12細胞中，根據本室以往所建立的方法篩選過表達細胞株。
1．2．2 免疫印跡分析
按《分子克隆實驗指南》所載方法進行，用1×SDS加樣緩沖液裂解細胞，收集細胞蛋白質，采用Bradford法進行蛋白定量。制備好的蛋白樣品置，80℃冰箱保存備用，每泳道上樣30μg蛋白，經10％SDS-PAGE(70V，120V分別電泳2h和4h左右)電泳后，電轉膜至硝酸纖維膜，室溫封閉后加入兔抗KLF4多克隆抗體，室溫孵育2h，加入HRP標記的羊抗兔IgG孵育1h，DAB顯色，拍攝照片，記錄試驗結果。
1．2．3 細胞形態觀察
取各轉染細胞于倒置顯微鏡下，觀察其生長速度和形態改變，并逐日記錄。
1．2．4 CCK-8法檢測細胞的增殖
取生長狀態良好的對數生長期各組細胞接種于96孔板(每孔1×104個細胞)，每組接種5個復孔，在含10％新生小牛血清的條件下分別培養24h，48h及72h后加入CCK-8溶液10μL繼續培養4h，將96孔板放人酶標儀，在450nm波長處測定各孔OD值。
1．2．5 流式細胞術檢測
本實驗由北京鼎國生物技術公司協助完成，分別接種等量的對數生長期的各組細胞于100mL培養瓶中，每組5瓶，培養24h后，參考該公司流式細胞檢測說明收集細胞，送北京鼎國生物技術有限公司進行流式細胞術分析。
1．2．6 統計學處理
數據以均數土標準差(x±s)表示，兩組間比較用t檢驗分析，以P＜0.05判斷為有統計學意義。
2 結果
2．1 Western blotting篩選高表達KLF4的細胞克隆
采用脂質體分別轉染KLF4的真核表達質粒pcDNA3.1-KLF4和空載體pcDNA3.1至Raw264.7和C2C12，細胞中，經G418篩選后，利用KLF4多克隆抗體進行Western印跡分析，鑒定高表達克隆，結果顯示，篩選到高表達克隆，在兩種細胞株中KLF4蛋白表達量較轉空載體組明顯增加(圖1)。
2．2 細胞生長情況
2．2．1 KLF4過表達對細胞形態的影響
KLF4過表達的Raw264.7細胞形態無明顯變化，C2C12空載體組貼壁細胞主要呈長梭形，極向或交叉排列，部分KLF4基因過表達的細胞形態發生改變，如細胞向多角形轉變，細胞形狀多樣等(見圖2)。
2．2．2 CCK-8法結果
Raw264.7的空載體組和KLF4組之間細胞增殖能力無明顯變化(p＞0.05)(表1)，C2C12的KLF4組與其空載體組相比較，細胞增殖能力降低(p＜0.05)(表2)。
2．2．3 流式細胞術分析KLF4對細胞周期及細胞凋亡的影響
利用流式細胞術檢測了Raw264.7-pcDNA3.1、Raw264.7-KLF4，C2C12-pcDNA3.1及C2C12-KLF4 4組細胞的周期分布及凋亡百分率，結果顯示轉染空載體和KLF4過表達對Raw264.7細胞的細胞周期分布及細胞凋亡無明顯影響(P＞0.05)；與轉
空載體的C2C12相比較，KLF4過表達的C2C12細胞中處于S期的細胞減少，而G1期的細胞相應增多(圖3)，凋亡細胞也增多(P＜0.05)(圖4)。
3 討論
KLF4是Kriippel樣鋅指轉錄因子家族的一個重要成員，小鼠KLF4蛋白全長包含483個氨基酸殘基，分子質量為53kD，和人的KLF4蛋白具有90％的相似性，KLF4蛋白的羧基端具有3個連續的C2H，鋅指結構，這3個鋅指的結構均符合保守序列：CX2-4CX3FX5LX2HX3H；兩個鋅指結構之間由一個7個氨基酸殘基的H/C連接序列連接，該連接序列為了GEKP(Y/F)X，KLF4能夠對角蛋白4(keratin)、腸堿性磷酸酶(intestinalalkaline phosphatase，IAP)、鳥氨酸脫羧酶(omithine decarboxylase，ODC)、β鏈蛋白(β-catenin)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1)和組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase，HDC)等多個啟動子的轉錄活性進行調控，從而在機體的生長和發育過程中起著重要的調節作用，對KLF4的研究最初是從胃腸道開始研究的，它的表達在生長抑制的狀態下明顯增高：此后的研究發現，KLF4除了在腸的不同組織中表達外，還在表皮有高水平的表達并在皮膚表皮細胞分化晚期起重要作用；KLF4缺失能導致皮膚屏障功能障礙從而使新生小鼠在出生后短時間內死亡，此外，最近的研究還表明，KLF4在細胞及其支持細胞的終末分化過程中出現高表達，這說明KLF4可能在哺乳動物發育過程中起到重要作用，但是，KLF4對Raw264.7細胞和C2C12細胞增殖的影響，目前尚未見報道。
為了闡明KLF4對Raw264.7細胞和C2C12細胞增殖的影響，本研究分別建立了KLF4過表達的Raw264.7和C2C12細胞株，并采用多種方法共同檢測了KLF4過表達對該兩種細胞增殖的影響，結果顯示，KLF4過表達對Raw264.7細胞的形態和增殖無明顯影響：而KLF4過表達的C2C12細胞株中，多角形的細胞增多，細胞周期中S期的細胞相對減少，細胞增殖速度明顯減慢，由此可見，KLF4對這兩種細胞增殖的影響具有顯著的細胞差異性。
【摘要】 目的: 克隆并構建含小鼠sST2和人IgG Fc 融合基因的真核表達質粒， 初步探討其表達產物sST2Fc融合蛋白對LPS刺激小鼠巨噬細胞生物學活性的影響。方法: 借助RTPCR技術， 從小鼠脾臟總RNA中擴增全長sST2 cDNA， 構建sST2與hIgG Fc段融合基因的真核表達載體（psST2Fc）。應用脂質體將重組質粒psST2Fc轉染CHO細胞， 經G418篩選， 獲得穩定表達sST2Fc融合蛋白的CHO細胞株。細胞培養上清經蛋白A親和層析純化后， 采用Western blot進行鑒定， 應用FACS檢測sST2Fc與RAW264.7巨噬細胞表面相應受體結合情況; ELISA法檢測sST2Fc對LPS刺激RAW264.7巨噬細胞分泌TNFα和IL6的影響。結果: 測序證實克隆和構建的小鼠sST2Fc cDNA閱讀框序列正確， Western blot 證實sST2Fc融合蛋白的表達， sST2Fc抑制LPS誘導巨噬細胞分泌的炎性細胞因子TNFα和IL6。結論: 成功構建sST2Fc融合基因并獲得穩定表達， sST2Fc通過與其特異性受體結合可抑制巨噬細胞介導的炎性反應。
【關鍵詞】 小鼠sST2Fc; 真核表達; RAW264.7; TNFα; IL6
ST2 最早被認為是由成纖維細胞分泌的一種血清免疫應答產物， 隨后發現肥大細胞［1］和Th2細胞［2］表面存在一種跨膜型ST2， 但其不表達在Th1細胞表面。目前證實ST2屬于IL1受體超家族成員， 但不能與IL1家族成員IL1α、 IL1β或IL1R拮抗劑結合。由于在mRNA水平剪切方式的差異， ST2基因表達產物以跨膜型（ST2L）和分泌型(sST2)兩種形式存在， 前者主要分布在源于造血細胞的細胞表面如肥大細胞和嗜酸性粒細胞， 而后者主要由成纖維細胞分泌產生。近來研究顯示， ST2除了誘導免疫應答由Th1型向Th2型偏移， 還涉及到類風濕性關節炎、 過敏性哮喘等多種疾病的發生發展［3， 4］。我們通過構建小鼠sST2人IgG1 Fc重組質粒（psST2Fc）并表達可溶性ST2Fc融合蛋白， 觀察其對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞生物學活性的影響， 為進一步應用該分子治療炎癥相關性疾病奠定基礎。
1 材料和方法
1.1 材料 BALB/c小鼠(8～12周齡， 雄性)由湖北省醫學實驗動物中心提供; CHO細胞購自中國典型培養物保藏中心; RAW264.7巨噬細胞由華中科技大學同濟醫學院免疫學系保藏。單克隆大鼠抗小鼠ST2抗體購自R&D公司。LPS和人IgG標準品購自Sigma公司， TRIzol試劑和脂質體LipofectAMINETM2000購自Invitrogen公司， RTPCR試劑盒購于MBI公司。各種限制性內切酶和T4 DNA連接酶購自Promega公司。Sepharose CL4B蛋白A親和層析柱購自Amersham Biosciences。DNA合成和測序由Invitrogen (上海)完成。
1.2 方法
1.2.1 重組表達載體的構建 采用TRIzol試劑提取BALB/c小鼠脾細胞總RNA， 經RTPCR擴增全長sST2 cDNA。PCR 引物的序列為: 5′AAA ACA AGC TTG GCC GCC ACC ATG ATT GAC AGA CAG AG3′和5′AAA ACG GAT CCG AGC AAT GTG TGA GGG ACA CTC CT3′。采用Hind III和BamH I分別雙酶切sST2和載體pcDNA3.1Fc， 將酶切片段sST2插入pcDNA3.1Fc載體Fc的上游， 構建重組表達載體psST2Fc， 轉化E.coli DH5α宿主菌， 篩選陽性克隆， 經酶切和測序鑒定。
1.2.2 轉染與篩選 用QIAGEN質粒試劑盒提取重組表達載體pcDNA3.1sST2Fc， 采用脂質體LipofectamineTM 2000轉染CHO細胞， 同時轉染空載體pcDNA3.1和未轉染細胞作為陰性對照。具體方法為: CHO細胞在含100 mL/L胎牛血清的DMEM中， 于37℃、 50 mL/L CO2飽和濕度下培養。轉染前1 d， 細胞用2.5 g/L胰酶消化并接種于24孔培養板中（細胞數為1×105/孔）， 待細胞融合至70％～80％時， 按LipofectamineTM 2000試劑說明書進行轉染， 并設空載體和未轉染組對照。培養48 h后， 加入G418(800 mg/L)篩選陽性抗藥克隆。
1.2.3 sST2Fc蛋白的純化及鑒定 收集細胞培養上清用Sepharose CL4B蛋白A親和層析柱純化sST2Fc融合蛋白， 純化樣品的濃度用A280吸收法測定。采用Western blot鑒定sST2Fc蛋白表達， 一抗為單克隆大鼠抗小鼠ST2抗體， HRP標記的兔抗大鼠為二抗， ECL化學發光法檢測。
1.2.4 流式細胞術分析 RAW264.7巨噬細胞在含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養液中， 于37℃、 50 mL/L CO2飽和濕度下培養。刺激前1 d， 將RAW264.7巨噬細胞接種于6孔細胞培養板， 細胞數為2×106/孔， 次日加入LPS（1 mg/L）刺激， 同時設立LPS未處理組。繼續培養24 h后收集細胞， 用預冷PBS洗滌3次， 細胞計數后分裝于流式細胞管（1×105/管）。加入Fc封閉抗體， 4℃孵育30 min， 用PBS洗滌3次， 分別加入sST2Fc（0.5 mg/L）和hIgG（0.5 mg/L）， 4℃孵育30 min， 用PBA（1×PBS， 含20 mL/L胎牛血清和1 g/L疊氮鈉）洗滌3次， 隨后加入同型對照抗體和FITC標記的山羊抗人Fc抗體， 4℃避光作用30 min， PBS洗滌3次后， 進行流式細胞術檢測。
1.2.5 RAW264.7巨噬細胞的培養和刺激 將RAW264.7巨噬細胞接種于24孔細胞培養板， 細胞數為5×105/孔， 第2天加入sST2Fc（0.5 mg/L）或hIgG（0.5 mg/L）， 同時設未處理對照組， 混勻培養3 h后， 加入LPS（1 mg/L）刺激， 繼續培養至24 h收集培養上清， -80℃保存。
1.2.6 ELISA檢測 采用ELISA檢測試劑盒(eBioscience) 測定細胞培養上清中TNFα和IL6的水平。
1.2.7 統計學分析 數據以x±s表示， 采用t檢驗， P
2 結果
2.1 重組sST2Fc表達載體的構建及鑒定 sST2 cDNA經RTPCR擴增， 酶切消化后， 插入pcDNA3.1Fc載體， 圖1顯示重組載體psST2Fc酶切后的片段大小與預期結果一致。序列測定結果表明， sST2序列與GenBank中注冊的序列完全一致(GI: 2171234)。
2.2 sST2Fc融合蛋白表達的鑒定 CHO細胞培養上清經Shepharose CL4B蛋白A親和層析純化后， Western blot分析顯示（圖2）， 在轉染psST2Fc實驗組中出現一個特異性條帶， 其相對分子質量（Mr）大小約100 000， 而在轉染pcDNA3.1和未轉染的對照組中未出現特異性條帶。
圖2 sST2Fc融合蛋白在CHO細胞中的表達
A: SDSPAGE檢測蛋白A親和層析純化sST2Fc蛋白; B: Western blot鑒定ST2Fc蛋白表達.2.3 sST2特異性結合RAW264.7巨噬細胞 為了檢測RAW264.7巨噬細胞表面是否存在sST2相應受體， 用流式細胞術分析sST2的特異性結合能力。圖3顯示， 在封閉RAW264.7巨噬細胞表面Fc受體后， sST2能特異性結合于RAW264.7細胞表面， 并且其結合強度伴隨LPS刺激而顯著上升。
圖3 sST2特異性結合巨噬細胞表面相應受體
A: RAW264.7巨噬細胞表面存在特異性sST2受體. 流式細胞術檢測hIgG (點線) 和sST2Fc(粗線) 與巨噬細胞表面相應受體結合 (其中細線代表同型對照). B: LPS上調RAW264.7巨噬細胞表面sST2受體表達. 巨噬細胞在LPS刺激前(點線)和刺激后(粗線)， sST2受體表達變化 (其中細線代表同型對照).
2.4 sST2抑制LPS刺激RAW264.7巨噬細胞分泌的TNFα和IL6 在LPS刺激下， RAW264.7細胞能上調結合sST2的能力， 故進一步檢測sST2對LPS激活巨噬細胞的生物學活性影響。在sST2或hIgG預處理RAW264.7巨噬細胞3 h后， 加入LPS（1 mg/L）繼續培養至24 h， 用ELISA檢測不同時間點細胞培養上清中TNFα和IL6的水平。結果顯示（圖4）， sST2能明顯抑制LPS刺激巨噬細胞分泌的炎性細胞因子TNFα和IL6， 而hIgG對照組則無此作用（P
3 討論
在細菌裂解產物如細菌脂蛋白、 LPS等因素刺激下， 巨噬細胞可產生大量的炎性細胞因子包括IL1α/β、 IL12、 TNFα及各種炎性介質如熱休克蛋白（HSP）、 氧自由基等， 它們在誘導機體產生天然免疫應答向特異性免疫應答偏移中發揮了重要作用［5］。廣泛性的細菌感染能引起這些炎癥物質產生混亂， 最終導致多器官衰竭和內毒素休克。ST2可通過調節Th1/Th2型免疫應答偏移而影響疾病的轉歸， 而且在炎性因子IL1α/β和TNFα刺激下， 成纖維細胞分泌sST2的水平上升; 經LPS預處理的人單核細胞產生sST2的水平亦增加， 這些結果均提示sST2可能參與了炎癥反應的調節作用［6］。
巨噬細胞表面與sST2特異性結合的受體及其相應功能尚未完全清楚。雖然ST2與IL1R具有高度同源性， 但未能發現它與已知的IL1家族成員IL1α、 IL1β或IL1R拮抗劑結合。目前， 巨噬細胞表面特異性ST2結合蛋白的cDNA序列已被克隆鑒定， 但是由該蛋白所介導的胞內信號傳遞途徑尚待明確［7］。現已知， ST2結合蛋白含有一個跨膜端以及由12個氨基酸短肽組成的胞內端， 故推測它可能與巨噬細胞識別sST2并介導下游相應的信號傳遞有關。本實驗通過流式細胞術應用重組sST2Fc融合蛋白證實RAW264.7巨噬細胞表面存在特異性的ST2結合蛋白， 并且ST2結合蛋白的表達水平在LPS刺激下顯著上升。或有可能， 與sST2結合的相應受體是巨噬細胞表面一種未知的IL1R家族新成員， 這有待進一步研究。
為了評價sST2在巨噬細胞所介導炎癥反應中的作用， 我們檢測了sST2Fc融合蛋白對LPS激活巨噬細胞的生物學活性影響。結果顯示， ST2Fc融合蛋白預處理組能明顯地抑制LPS誘導巨噬細胞產生的炎性細胞因子TNFα和IL6。亦有文獻報道［8］， sST2能有效抑制肺泡巨噬細胞促炎性細胞因子TNFα、 IL1和IL6的基因轉錄和蛋白表達， 而抗炎性細胞因子IL10、 TGFβ及NO的表達水平未受影響， 從而證實sST2通過直接與細胞表面受體相結合而發揮作用， 并非通過間接途徑。并且， sST2預處理可明顯抑制巨噬細胞TLR4受體mRNA的轉錄， 這種下調LPS相應受體信號途徑的能力， 在一程度上解釋了sST2對炎癥反應的調節作用。由此可見， 通過進一步明確下調巨噬細胞所介導炎癥反應的作用機制， sST2有望成為一種治療內毒素休克及炎癥相關性疾病的新途徑。
參考文獻
［1］ Moritz DR， Rodewald HR， Gheyselinck J， et al. The IL1 receptorrelated T1 antigen is expressed on immature and mature mast cells and on fetal blood mast cell progenitors［J］. J Immunol， 1998， 161(9): 4866-4874.
［2］ Xu D， Chan WL， Leung BP， et al. Selective expression of a stable cell surface molecule on type 2 but not type 1 helper T cells［J］. J Exp Med， 1998， 187(5): 787-794.
［3］ Leung BP， Xu D， Culshaw S， et al. A novel therapy of murine collageninduced arthritis with soluble T1/ST2［J］. J Immunol， 2004， 173(1): 145-150.
［4］ Hayakawa H， Hayakawa M， Kume A， et al. Soluble ST2 blocks interleukin33 signaling in allergic airway inflammation［J］. J Biol Chem， 2007， 282(36): 26369-26380.
［5］ 尹華華， 朱京慈， 李 磊. 巨噬細胞的異質性［J］. 細胞與分子免疫學雜志， 2004， 20(4): 510-512.
［6］ Kakkar R， Lee RT. The IL33/ST2 pathway: therapeutic target and novel biomarker［J］. Nat Rev Drug Discov， 2008， 7(10): 827-40.
【摘要】目的 觀察腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和microRNA-146a在脂多糖(LPS) 誘導的NR8383肺泡巨噬細胞中的動態表達，分析二者在時間上的變化關系，探討microRNA-146a對肺泡巨噬細胞炎癥反應的調控作用及其機制。方法 體外培養的肺泡巨噬細胞接種于六孔板，貼壁后加入1 μg/mL的LPS，刺激0、3、6、12 h后離心收集培養上清液和細胞。采用實時熒光定量PCR檢測細胞中microRNA-146a和TNF-α mRNA的表達，酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測培養上清液中TNF-α蛋白水平的表達。microRNA-146a和TNF-α mRNA的相關性采用雙變量Pearson相關性分析。結果 （1）培養上清液中的TNF-α蛋白在LPS刺激3 h后顯著升高［（359.80±57.54 )pg/mL，P＜0.01］，于12 h達高峰［(729.22±50.40 )pg/ml，P＜0.01］；（2）LPS刺激3 h后，細胞中TNF-α mRNA的表達即達到頂峰［（67.48±24.52)倍，P＜0.01］，6 h后開始降低［（29.53±4.26)倍，P＜0.05］；（3）LPS刺激6 h后，microRNA-146a表達水平顯著增高［（5.33±0.81)倍，P＜0.01］，并且持續增高［12 h：(8.21±1.19)倍，P＜0.01］；（4）細胞中microRNA-146a的表達水平與TNF-α mRNA的含量呈負相關（r=-0.895，P＜0.01）。結論 在LPS誘導的肺泡巨噬細胞中， microRNA-146a的表達水平與TNF-α mRNA的含量呈負相關，推測microRNA-146a可能參與了肺泡巨噬細胞的炎癥反應調控。
【關鍵詞】microRNA-146a；肺泡巨噬細胞；腫瘤壞死因子-α；實時熒光定量PCR；炎癥
The relationship between microRNA-146a and TNF-α in lipopolysaccharide-stimulated alveolar macrophages of rats ZENG Zhen-guo,GONG Hong-han, LI Yong, NIE Zhen-yun, JIE Ke-min, ZHAN Yi-an, NIE Cheng, LIU Fen, DING Cheng-zhi, SHAO Qiang, QING Cheng, ZHU Bai-lu, QIAN Ke-jian.省略
【Abstract】Objective To determine kinetics of TNF-α and miR-146a (microRNA-146a) expressions in lipopolysaccharide (LPS)-induced NR8383 alveolar macrophages (AM) at different intervals and their relationships in order to explore regulatory effect and mechanism of miR-146a on alveolar macrophages inflammatory responses.Methods NR8383 alveolar macrophages were seeded in a 6-well plate, and stimulated with 1 μg/ml of LPS for 0 h, 3 h, 6 h and 12 h separately after 90 min. Cells were harvested and supernatant were collected 0 h, 3 h, 6 h and 12 h after incubation. The expressions of miR-146a and TNF-α mRNA in cells were detected by real-time qPCR and the levels of TNF-α protein in the supernatant of cells were assayed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Pearson correlation analysis was used to analyze the correlation between miR-146a and TNF-α mRNA. Results ①The level of TNF-α protein in the supernatant of cell was significantly increased 3 h after LPS challenge (359.80±57.54) pg/ml (P
【摘要】 【目的】 探討辛伐他汀含藥血清對U937單核細胞源巨噬細胞基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）及金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）表達與分泌的影響。【方法】 15只新西蘭大白兔隨機分為正常對照組（NL， n=5）、粥樣硬化模型組（AS， n=5）和辛伐他汀含藥血清組（SIM， n=5）。通過喂養高脂飼料，建立兔動脈粥樣硬化模型后，予辛伐他汀藥液灌胃，獲得含藥血清。分別予不同濃度含藥血清（5%、10%、20%）培養U937單核細胞源巨噬細胞24 h，應用逆轉錄聚合酶鏈反應檢測MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA的表達，以及應用酶聯免疫吸附試驗檢測MMP-9及TIMP-1蛋白的分泌。【結果】與相同濃度AS組比較，5%、10%、20% SIM組U937單核細胞源巨噬細胞MMP-9 mRNA表達均顯著性降低（P值為0.005、0.041和0.013）；5%、10%、20% SIM組TIMP-1 mRNA表達無顯著性差異（P值均 >0.05）。而與相同濃度AS組比較，不僅10%、20% SIM組MMP-9分泌顯著性減少（P值分別為0.009和0.001），而且10%、20%SIM組TIMP-1分泌均顯著性增加 （P值分別為0.017和0.001）。 【結論】 辛伐他汀可抑制單核巨噬細胞MMP-9的表達和分泌，以及促進TIMP-1的分泌。
【關鍵詞】 辛伐他汀； 巨噬細胞； 基質金屬蛋白酶-9； 金屬蛋白酶組織抑制因子-1
Abstract:【Objective】 To investigate the effects of simvastatin drug-serum on the expression and secretion of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in U937 monocyte-derived macrophages. 【Methods】 Fifteen New Zealand rabbits were randomized to 3 groups， normal control group (NL， n=5)， atherosclerotic model group (AS， n=5) and simvastatin drug-serum group (SIM， n =5). The rabbit atherosclerotic model was developed by high cholesterol feeding. Then they were medicated with simvastatin liquor by gavage to prepare simvastatin drug-serum. U937 monocyte-derived macrophages were incubated with different concentrations (5%， 10%， and 20%) of simvastatin drug-serum for 24 hours. The mRNA expression and protein secretion of MMP-9 and TIMP-1 were detected by RT-PCR and ELISA. 【Results】 Compared to same concentration AS group， 5%， 10%， and 20% SIM group significantly inhibited the expression of MMP-9 mRNA in U937 monocyte-derived macrophages (P=0.005， 0.041， and 0.013)， and the expression difference of TIMP-1 mRNA were not significant (all P >0.05). Compared to same concentration AS group， 10% and 20% SIM group not only significantly inhibited the secretion of MMP-9 in U937 monocyte-derived macrophages (P=0.009 and 0.001)， but also significantly increased the secretion of TIMP-1 ( P = 0.017 and 0.001) . 【Conclusion】 Simvastatin inhibits the expression and secretion of MMP-9 and enhances the secretion of TIMP-1.
Key words: simvastatin; macrophage; matrix metalloproteinase-9; tissue inhibitor of metalloproteinase-1
冠狀動脈粥樣硬化斑塊由穩定轉為不穩定，繼而破裂導致血栓形成是急性冠脈綜合征最主要的發病機制[1， 2]。斑塊脂質核心大、纖維帽薄、巨噬細胞多是結構性易損斑塊[3]。斑塊內單核巨噬細胞聚集，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMP）增多，金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases， TIMP）減少，導致斑塊內膠原降解，纖維帽變薄，是斑塊穩定性下降的重要原因[4， 5]。臨床研究顯示他汀對急性冠脈綜合征治療有效，可能與改善內皮功能、抗炎及穩定斑塊等調脂以外的作用有關［6］，但其具體機制尚未完全明確。本研究擬觀察辛伐他汀含藥血清對U937單核細胞源巨噬細胞MMP-9及TIMP-1表達與分泌的影響，以探討辛伐他汀穩定斑塊、治療急性冠脈綜合征的機制。
1 材料與方法
1.1 材料準備
雄性純種新西蘭大白兔，體質量2.0~2.5 kg，購自中山大學動物實驗中心。人單核白血病細胞株U937細胞，購自中山大學動物實驗中心細胞庫。辛伐他汀藥片，購自默沙東公司，實驗時溶解于蒸餾水灌胃。
RPMI 1640培養基，購自Gibco公司。新生牛血清，購自PAA公司。佛波酯（PMA），購自Sigma公司。Trizol reagent，購自Invitrogen公司。逆轉錄試劑盒，購自Fermentas公司。Taq酶購自Takara公司。PCR反應引物，由上海生工生物技術有限公司合成。人MMP-9、TIMP-1細胞上清ELISA試劑盒，購自RapidBio公司。
1.2 動脈粥樣硬化模型建立及含藥血清制備
15只新西蘭大白兔隨機分為3組：正常對照組（normal， NL）、粥樣硬化模型組（atherosclerosis group， AS）和辛伐他汀含藥血清組（simvastatin group， SIM），每組5只。正常對照組予普通飼料喂養12周，其余各組予高脂飼料（1%膽固醇、10%豬油、89%普通飼料）喂養10周后，每組隨機處死1只，證實有大動脈粥樣硬化形成后，繼續高脂喂養至12周，其中SIM組于第11周起給予辛伐他汀5 mg/kg，每天1次，灌胃14 d。末次給藥前禁食12 h，給藥后1 h頸動脈無菌取血，分離血清，同組動物血清混勻，0.22 ?滋m濾膜過濾滅菌，-80 ℃保存備用。
1.3 細胞培養及干預
U937細胞培養于含10%新生牛血清的RPMI 1640培養基中，置于含5% CO2，37 ℃培養箱中，待細胞生長至接近融合時傳代，2~3代后用于實驗。調整細胞密度為5×106/mL，接種于6孔培養板，加入PMA使終濃度為50 ng/mL，培養48 h后見懸浮生長的U937細胞分化為巨噬細胞，伸出偽足，貼壁生長。棄去舊培養基，PBS液洗滌后，予不含血清的RPMI 1640培養基繼續培養24 h，棄去培養基。分別加入各含5%、10%、20%正常兔血清，5%、10%、20%粥樣硬化兔血清，以及5%、10%、20%辛伐他汀含藥血清的RPMI 1640培養基，每組設3個平行組，培養24 h用于RT-PCR實驗。
1.4 總RNA提取
吸凈培養基，每孔加入1 mL的Trizol液，吹打裂解細胞，收集于無RNA酶離心管中，室溫靜置5 min。加入0.2 mL氯仿，劇烈顛倒15 s，室溫靜置3 min，4 ℃，12 000 × g離心10 min。轉移上層水相液500 ?滋L到新的離心管，加入500 ?滋L異丙醇，室溫靜置10 min，4 ℃，12 000 × g離心7 min。棄上清，加入1 mL無RNA酶水配制的75%酒精，振蕩混勻，4 ℃，7 500 × g離心5 min。重復酒精洗滌沉淀一遍，棄去酒精，室溫干燥5 min，融解RNA于30 ?滋L無RNA酶水中，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度計測定RNA含量，計算出RT-PCR所需樣品量。
1.5 RT-PCR
取總RNA1.5 ?滋g，按逆轉錄試劑盒進行逆轉錄合成cDNA。以β-actin為內參照，進行半定量逆轉錄聚合酶鏈式反應。聚合酶鏈式反應：95 ℃ 5 min預變性，94 ℃ 45 s變性，56 ℃ 30 s退火，72 ℃ 45 s延伸，共35個循環，最后一次循環在72 ℃延伸7 min。RT-PCR產物用含1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Labwork成像系統采集圖像及分析。合成引物序列，MMP-9-上游引物：5′- AGGACGGCA ATGCTGAT-3′，下游引物：5′- CGCCACGA GGAACAAACT-3′，擴增產物為362 bp；TIMP-1-上游引物：5′- TTCCGACCTCGTCATCAG-3′，下游引物：5′- GCATTCCTCACAGCCAAC-3′，擴增產物為340 bp；β-actin-上游引物：5′- ATCGTGCGTGA CATTAAGG-3′，下游引物：5′-ACAGGACTCC ATGCCCAGG-3′，擴增產物為195 bp。
1.6 ELISA測定
收集細胞上清液，4 ℃，3 000 r/min離心10 min，取上清，-80 ℃保存待檢。ELISA采用雙抗體夾心法，按照說明書步驟進行，測定細胞上清MMP-9、TIMP-1濃度。
1.7 統計學處理
所有數據均以均數±標準差（x±s）表示，三組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用LSD-t 檢驗，應用SPSS 10.0統計分析軟件進行統計分析，P< 0.05 為差異有顯著性。
2 結 果
2.1 辛伐他汀含藥血清對U937單核源巨噬細胞MMP-9 mRNA表達的影響
與相同濃度NL組相比，5%、10%、20%AS組MMP-9 mRNA表達均顯著性增高（P值均< 0.05）。與相同濃度AS組相比，5%、10%、20%SIM組MMP-9 mRNA表達均顯著性降低（P值分別為0.005、0.041和0.013）。與相同濃度NL組相比，5%、10%SIM組MMP-9 mRNA表達均增高（P值分別為0.034和0.029，表1、圖1）。
不同濃度間SIM組MMP-9 mRNA表達差別無統計學意義（F=1.747，P=0.252）。
2.2 辛伐他汀含藥血清對U937單核源巨噬細胞TIMP-1 mRNA表達的影響
NL組、AS組和SIM組不同濃度之間TIMP-1 mRNA表達無顯著差異（表2、圖2）。5%、10%和20%SIM組之間TIMP-1 mRNA的表達有顯著性差異（F= 6.498，P=0.032）。與5%SIM組相比，10%、20%SIM組TIMP-1 mRNA的表達顯著性增加（P=0.039、0.014），而10%與20%SIM組之間無顯著性差異（P=0.446）。
2.3 辛伐他汀含藥血清對U937單核源巨噬細胞MMP-9蛋白分泌的影響
與同濃度NL組比較，10%、20%AS組MMP-9分泌均顯著性增加（P=0.007、0.002）；5%、10%、20%SIM組MMP-9分泌無顯著性差異（P=0.824、0.857、0.658）。與同濃度AS組比較，5%SIM組MMP-9分泌無顯著性差異（P=0.427），10%、20%SIM組MMP-9分泌顯著性減少（P=0.009、0.001，表3）。
SIM組不同濃度之間MMP-9分泌無顯著性差異（F=0.985，P=0.427）。
2.4 辛伐他汀含藥血清對U937單核源巨噬細胞TIMP-1蛋白分泌的影響
與同濃度NL組比較，AS組TIMP-1分泌均顯著性減少（P=0.004、0.044、0.003）；與同濃度NL組比較，5%SIM組TIMP-1分泌減少（P=0.038）。與同濃度AS組比較，10%、20%SIM組TIMP-1分泌均顯著性增加（P=0.017、0.001，表4）。
SIM組不同濃度之間TIMP-1分泌有顯著性差異（F=6.555，P=0.031）。與5%SIM組相比，10%、20%SIM組 TIMP-1分泌均顯著性增加（P=0.038和0.014）。而10%和20%含藥血清之間差異無顯著性（P=0.456）。
3 討 論
3. 1 MMP/TIMP與動脈粥樣斑塊穩定性
急性冠狀動脈綜合征患者是易損病人[1]，通常指在冠狀動脈粥樣硬化的基礎上，斑塊破裂，繼而血小板粘附聚集和血栓形成，引起完全或不完全的血管阻塞，導致不穩定型心絞痛、非ST段抬高心肌梗死、ST段抬高心肌梗死及猝死。有報道[7-9]冠脈“罪犯”病變處多是軟斑塊、以正性重構為主，常伴血栓形成。斑塊內細胞外基質過度降解，導致斑塊中膠原含量減少，纖維帽變薄，是影響斑塊穩定的重要因素。斑塊破裂常發生在富含單核巨噬細胞的斑塊肩部，此處巨噬細胞可分泌大量MMP，促進纖維帽降解[10]。MMP-9，又稱明膠酶B，是巨噬細胞分泌的主要基質金屬蛋白酶。TIMP是MMP的抑制物，目前已發現有4種：TIMP-1～TIMP-4，它們均可與激活的MMP 呈1 ∶ 1結合，從而使MMP失活。用免疫組化方法檢測動脈粥樣硬化斑塊顯示TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3顯著性增多，且多存在于斑塊肩部的巨噬細胞、纖維帽和脂核內，與MMP分布部位一致，部分抑制MMP的活性[11]。急性冠脈綜合征患者存在著由炎癥反應導致的以MMP-9升高為主的MMP-9/ TIMP-1失衡狀態[2]。因此MMP與TIMP之間的平衡，對斑塊穩定性的調節具有重要意義。研究還表明[12]，MMP-9在轉錄水平上受多種細胞因子、生長因子及活性物質的調節，而TIMP的表達很少受細胞因子和生長因子的影響。本實驗采用血清藥理學方法觀察到，與同濃度NL組相比較，5%、10%和20%AS組U937單核源巨噬細胞MMP-9表達均顯著性增高（P值均< 0.05）。這可能是因為粥樣硬化血清中含有較高的低密度脂蛋白膽固醇，以及大量激活的炎性細胞因子、生長因子以及其他活性物質，促進MMP -9的表達。與相同濃度NL組比較，AS組TIMP-1 mRNA表達無顯著性差異，但TIMP-1的分泌均顯著性減少（P< 0.05），提示動脈粥樣硬化血清不但可使巨噬細胞MMP-9增加，同時還可使TIMP-1分泌增加（翻譯后水平）而表達（mRNA水平）并未增加，具體機制尚不清楚。
3. 2 他汀藥與MMP/TIMP
PROVE IT（TIMI-22）研究[13]顯示強化他汀治療可使ACS患者30 d的臨件減少，在穩定的患者，使臨件長期降低，但其具體機制尚未完全明確。Luan等[14]報道，西立伐他汀呈劑量依賴性抑制兔平滑肌細胞和巨噬細胞MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9，但對TIMP-1和TIMP-2無影響。本研究顯示，與相同濃度AS組相比，5%、10%和20%SIM組MMP-9 mRNA表達均顯著性降低（P值< 0.05）；10%、20%SIM組MMP-9蛋白的分泌顯著性減少（P值均< 0.01）。與相同濃度AS組相比，SIM組TIMP-1 mRNA表達無顯著性差異（P >0.05）；但10%、20%SIM組TIMP-1分泌均顯著性增加（P值均< 0.01）。與Luan等[14]的報道有所不同，本研究顯示辛伐他汀不但在一定劑量范圍內可抑制巨噬細胞MMP-9的轉錄與分泌，而且增加TIMP-1的分泌。這可能是辛伐他汀穩定斑塊、減少臨件的機制之一。他汀具有多效作用（Pleiotropic effects）[15]，除了調脂作用外，還有抗炎、改善內皮功能等作用。辛伐他汀可能通過抑制巨噬細胞MMP-9的轉錄與分泌，同時還增加TIMP-1的分泌，從而調節MMP與TIMP之間的平衡，起到穩定斑塊的作用。
參考文獻
FALK E，SHAH P K，FUSTER V. Coronary plaque disruption [J]. Circulation，1995，92(3)：657-671.
劉金來， 關良勁， 謝旭晶， 等. 急性冠狀動脈綜合征患者血漿基質金屬蛋白酶及其抑制因子的變化[J]. 中國病理生理雜志，2004，20(10)：1921-1922.
NAGHAVI M， LIBBY P， FALK E， et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I[J]. Circulation， 2003， 108(14) : 1664-1672.
CRISBY M， NORDIN-FRIDRIKSSON G， SHSH P K， et al. Pravastatin treatment increases collagen content and decreases lipid content， inflammation， metallproteinases， and cell death in human carotid plaques : implications for plaque stabilization[J]. Circulation， 2001， 103(7) : 926-933.
劉金來， 關良勁， 朱承明， 等. 急性冠狀動脈綜合征患者頸動脈斑塊與血漿基質金屬蛋白酶的相關性 [J]. 中國動脈硬化雜志， 2005， 13（6）: 763-766.
林 玲， 歐少雯， 呂 紅， 等. 阿托伐他汀對老年冠心病患者血小板?琢顆粒膜蛋白的MP-140的影響 ［J］. 熱帶醫學雜志， 2007，7（1）：55-56.
KOTANI J， MINTZ G S， CASTAGNA M T， et al. Intravascular ultrasound analysis of infarct-related and non-infarct-related arteries in patients who presented with an acute myocardial infarction[J]. Circulation， 2003，23（107）: 2889-2893.
VARNAVA A M， MILLS P G， DAVIES M J， et al. Relationship between coronary artery remodeling and plaque vulnerability [J]. Circulation， 2002， 105(8) : 939-943.
王 慶，凌文華. C反應蛋白與動脈粥樣硬化不穩定斑塊[J]. 中山大學學報：醫學科學版，2004， 25（3S）：384-386.
LENDON C L， DAVIES M， BORN G， et al. Atherosclerotic plaque caps are locally weakened when macrophage density is increased[J]. Atherosclerosis， 1991， 87(1) : 87-90.
FABUNMI R P， SUKHOVA G K， SUGIYAMA S， et al. Expression of tissue inhibitor of metalloproteinases-3 in human atheroma and regulation in lesion-associated cells: a potential protective mechanism in plaque stability[J]. Circ Res， 1998， 83(3): 270-278.
VAN DEN STEEN P E， DUBOIS B， NELISSEN I， et al. Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) [J]. Crit Rev Biochem Mol Biol， 2002， 37(6) : 375-536.
RAY K K， CANNON C P， MCCABE C H， et al， PROVE IT-TIMI 22 Investigators. Early and late benefits of high-dose atorvastatin in patients with acute coronary syndromes: results from the PROVE IT-TIMI 22 trial [J]. J Am Coll Cardiol， 2005， 46(8):1405-1410.
